Ключова разлика – северно срещу южно срещу западно попиване
Откриването на специфични последователности на ДНК, РНК и протеини е от съществено значение за различни видове изследвания в молекулярната биология. Гел електрофорезата е техника, която разделя ДНК, РНК и протеини според техните размери. От профилите на гела, определена ДНК последователност, РНК последователност или протеин се откриват чрез специалните техники, наречени блотиране и хибридизация с белязани сонди. Има три различни типа метода за попиване, а именно южен, северен и западен. Ключовата разлика между Northern Southern и Western blotting се крие в типа на молекулата, която открива от проба. Southern blotting е метод, който открива специфична ДНК последователност от ДНК проба. Northern blotting е техника, която открива специфична РНК последователност от РНК проба. Western blotting е метод, който открива специфичен протеин от протеинова проба.
Какво е Southern Blotting?
Техниката Southern blotting е разработена от E. M. Southern през 1975 г. за идентифициране на специфична ДНК последователност от ДНК проба. Това е първата блотинг техника, въведена в молекулярната биология. Той даде възможност за откриване на специфични гени от ДНК, специфични фрагменти от ДНК и т.н. Има няколко стъпки, включени в техниката на Southern blotting. Те са както следва.
- ДНК се изолира от пробата и се смила с рестрикционни ендонуклеази.
- Разградената проба се отделя чрез електрофореза с агарозен гел.
- ДНК фрагментите в гела се денатурират в единични вериги с помощта на алкален разтвор.
- Едноверижната ДНК се прехвърля към нитроцелулозна филтърна мембрана чрез капилярен трансфер.
- Прехвърлената ДНК се фиксира трайно върху мембраната.
- Фиксираната ДНК върху мембраната се хибридизира с белязани сонди.
- Несвързаната ДНК се отмива от мембраната чрез измиване.
- Рентгеновият филм се излага на мембраната и се подготвя авторадиография.
Southern blotting се прилага за различни аспекти на молекулярната биология. Полезен е при RFLP картографиране, криминалистични изследвания, ДНК метилиране в генна експресия, откриване на мутирали гени при генетични заболявания, ДНК пръстови отпечатъци и др.
Фигура 01: Техника на южно попиване
Какво е Northern Blotting?
Northern blotting е метод, предназначен за откриване на специфична РНК последователност или иРНК последователност от проба за изследване на генната експресия. Тази техника е разработена от Alwine, Kemp и Stark през 1979 г. Тя се различава от техниките за южно и западно попиване поради няколко стъпки. Въпреки това, тази техника се извършва и чрез гел електрофореза, блотиране и хибридизация със специфични белязани сонди и откриване. Техниката Northern blotting се извършва, както следва.
- РНК се извлича от пробата и се разделя чрез гел електрофореза.
- РНК се прехвърля от гела върху попиваща мембрана и се фиксира.
- Мембраната се третира с белязана сонда, приготвена от сДНК или РНК (сондата е комплементарна на специфична последователност в пробата).
- Сондата се инкубира с мембраната, за да се свърже със специфична последователност.
- Несвързаните сонди се отмиват.
- Хибридизираните фрагменти се откриват от авторадиограф.
Northern blotting е важен инструмент за откриване и количествено определяне на хибридизирана иРНК, изследване на разграждането на РНК, оценка на полуживота на РНК, откриване на сплайсинг на РНК, изследване на генна експресия и др.
Фигура 02: Northern Blotting
Какво е Western Blotting?
Western blotting е метод за откриване на специфичен протеин от протеинова смес чрез използване на белязано антитяло. Следователно Western blot е известен също като имуноблот. Тази техника е въведена от Towbin et al през 1979 г. и сега се извършва рутинно в лабораториите за анализ на протеини. Стъпките са както следва.
- Протеините се извличат от пробата
- Протеините се разделят по техните размери с помощта на електрофореза с полиакриламиден гел
- Разделените молекули се прехвърлят в PVDF мембрана или нитроцелулозна мембрана чрез електропорация
- Мембраната е блокирана за неспецифично свързване с антителата
- Прехвърлените протеини се свързват с първично антитяло (ензимно белязани антитела).
- Мембраната се измива, за да се отстранят неспецифично свързани първични антитела
- Свързаните антитела се откриват чрез добавяне на субстрат и откриване на образуваната цветна утайка
Western blotting е полезен при откриването на анти-HIV антитела в проба от човешки серум. Western blot може също да се използва като потвърдителен тест за инфекция с хепатит B и окончателен тест за болестта луда крава.
Фигура 03: Western blotting
Каква е разликата между Northern Southern и Western Blotting?
Северно срещу Южно срещу Западно попиване |
|
| Тип на откритата молекула | |
| Northern Blotting | Northern blotting открива специфична РНК последователност от РНК проба. |
| Southern Blotting | Southern blotting открива специфична ДНК последователност от ДНК проба. |
| Уестърн блотинг | Western blotting открива специфичен протеин от протеинова проба. |
| Вид гел | |
| Northern Blotting | Това използва агарозен/формалдехиден гел. |
| Southern Blotting | Това използва агарозен гел. |
| Уестърн блотинг | Това използва полиакриламиден гел. |
| метод на попиване | |
| Northern Blotting | Това е капилярен трансфер. |
| Southern Blotting | Това е капилярен трансфер. |
| Уестърн блотинг | Това е електрически трансфер. |
| Използвани сонди | |
| Northern Blotting | кДНК или РНК сонди, маркирани радиоактивно или нерадиоактивно. |
| Southern Blotting | ДНК сондите се маркират радиоактивно или нерадиоактивно. |
| Уестърн блотинг | Първичните антитела се използват като сонди. |
| Система за откриване | |
| Northern Blotting | Това се прави с помощта на авторадиография или откриване на светлина или промяна на цвета. |
| Southern Blotting | Това се прави с помощта на авторадиограф, откриване на светлина или промяна на цвета. |
| Уестърн блотинг | Това се прави чрез откриване на светлина или промяна на цвета. |
Обобщение – северно срещу южно срещу западно попиване
Блотингът е специална техника, разработена за идентифициране на специфична ДНК, РНК или протеин от пробите. Има три отделни процедури за попиване, а именно северна, южна и западна, за откриване на специфичен тип молекула. Northern blotting техниката е предназначена за откриване на специфична РНК последователност от смес от РНК. Southern blotting техниката позволява откриването на специфична ДНК последователност от ДНК проба, а Western blotting техниката е разработена за идентифициране на специфичен протеин от протеинова смес.
