Ключова разлика – SYBR Green срещу Taqman
SYBR Green и Taqman са два метода, използвани за откриване или наблюдение на процеса на амплификация на PCR в реално време. SYBR Green е метод, базиран на интеркалираща боя за оцветяване на нуклеинови киселини, докато Taqman е метод, базиран на сонда за хидролиза. И двете технологии са проектирани да генерират флуоресценция по време на PCR, което позволява на PCR машината в реално време да наблюдава реакцията в „реално време“. Методът SYBR Green се извършва с помощта на флуоресцентно багрило, наречено SYBR green, и открива амплификацията чрез свързване на багрилото към произведената двойноверижна ДНК. Taqman се извършва с помощта на двойно белязани сонди и открива амплификацията чрез разграждане на сондата от Taq полимераза и освобождаване на флуорофора. Това е ключовата разлика между SYBR Green и Taqman.
Какво е SYBR Green?
SYBR Green е флуоресцентно багрило, използвано за оцветяване на нуклеинови киселини, особено двойноверижна ДНК в молекулярната биология. Методът SYBR Green се използва за количествено определяне на PCR продукти по време на PCR в реално време. След като се свърже с ДНК, полученият комплекс ДНК-багрило абсорбира синя светлина и излъчва интензивна зелена светлина. Това се случва поради структурната промяна, която настъпва в молекулата на багрилото при свързване с двойноверижна ДНК. Когато PCR създава все повече и повече ДНК, повече молекули на багрилото се свързват с ДНК, генерирайки повече флуоресценция. Следователно, флуоресценцията се увеличава с натрупването на PCR продукт. Следователно, количеството на PCR продукта може да бъде количествено измерено чрез SYBR Green флуоресцентно откриване.
Зеленото багрило SYBR може също да се използва за маркиране на ДНК при цитометрия и флуоресцентна микроскопия. Етидиевият бромид е успешно заменен от SYBR Green, тъй като етидиевият бромид е канцерогенно багрило с проблеми при изхвърляне по време на ДНК визуализация в гел електрофореза.
Има предимства и недостатъци на зеления метод SYBR. Този метод е много чувствителен, евтин и лесен за използване. Въпреки това, поради способността му да се свързва с всяка двойноверижна ДНК, неспецифичното свързване може да доведе до прекомерно количествено определяне на PCR продукта.
Фигура 01: SYBR Green Technique
Какво е Taqman?
Taqman е алтернативен метод на SYBR Green за наблюдение на PCR процеса в реално време. Този метод зависи от 5’ – 3’ екзонуклеазната активност на ензима Taq полимераза за разграждане на сондите по време на удължаването на новата верига и освобождаването на флуорофор. В този метод се използват двойно маркирани сонди и той се основава на хидролиза на сонди. Сондите са флуоресцентно белязани ДНК олигонуклеотиди, имащи флуоресцентна репортерна молекула (флуорофор) в 5' края и гасителна молекула в 3' края. Те са проектирани да се свързват с едноверижния шаблон от противоположната страна на загряването на праймера. Taq полимеразата добавя нуклеотиди към праймера и разширява новата верига към двойно белязаните проби. След като Taq полимеразата срещне сондата, екзонуклеазното действие на Taq полимеразата активира и разгражда сондата. След като завърши синтеза на новата верига, сондата се подлага на пълно разграждане и освобождаване на флуорофора. Освобождаването на флуорофор генерира флуоресценция. Молекулата на флуоресцентния гасител ефективно потушава излъчената светлина и създава резултат за количествено определяне на PCR продукта. Освобождаването на флуорофори и количеството на PCR продуктите са пропорционални. Следователно, количественото определяне може лесно да се направи по метода Taqman.
Фигура 02: Метод Taqman
Методът Taqman се използва в PCR в реално време, количествено определяне на генна експресия, откриване на генетични полиморфизми, количествено определяне на делеции на хромозомна ДНК, бактериална идентификация, проверка на анализ на микрочипове, SNP генотипиране и др.
Каква е разликата между SYBR green и Taqman?
SYBR Green срещу Taqman |
|
| SYBR Green се основава на багрило, свързващо ДНК. | Taqman зависи от хибридизационни проби и 5' до 3' екзонуклеазна активност на Taq полимераза. |
| Флуоресцентно маркирани сонди | |
| Не са необходими флуоресцентно маркирани сонди. | Необходими са сонди с двоен етикет. |
| Мултиплексен генен анализ | |
| Не може да се използва за мултиплексни генни цели. | Може да се използва за мултиплексни генни цели. |
| Цена | |
| Това е по-евтино. | Това е по-скъпо. |
| Специфичност | |
| Това е по-малко специфично и се свързва с всяка двуверижна ДНК | Те са силно специфични, тъй като сондите откриват специфичните продукти на усилване. |
| Ефективност | |
| Това е по-малко ефективно. | Това е много ефективно. |
| Приложение | |
| Това се използва при PCR в реално време, визуализация на агарозен гел, ДНК маркиране и др. | Това се използва в PCR в реално време, количествено определяне на генната експресия, откриване на генетични полиморфизми и др. |
Резюме – SYBR Грийн и Такман
Taqman и SYBR зелено са два метода, използвани в PCR в реално време (количествена PCR). И двата метода позволяват ефективно количествено определяне на PCR продукта и разчитат на излъчването на флуоресценция. Методът Taqman използва двойно белязани сонди за откриване на натрупаната ДНК, докато методът SYBR Green използва флуоресцентно багрило. И двата метода имат различни приложения в молекулярната биология.
