Ключова разлика – Maxam Gilbert срещу Sanger Sequencing
Нуклеотидите са основните структурни единици и градивни елементи на ДНК. ДНК молекулата е изградена от полинуклеотидна верига. В ДНК има четири различни нуклеотида. Тези нуклеотиди са съставени от четири различни азотни бази, наречени А (аденин), G (гуанин), С (цитозин), Т (тимин). Редът на нуклеотидите в молекулата на ДНК е от голямо значение, тъй като кодира важна генетична информация за растежа и развитието на организмите. Секвенирането на ДНК се отнася до процеса, който определя точната нуклеотидна последователност на ДНК. Има различни методи за секвениране на ДНК. Секвенирането на Maxam Gilbert и секвенирането на ДНК на Sanger са два метода за секвениране на ДНК, които принадлежат към секвенирането от първо поколение. Процедурата за секвениране на Maxam Gilbert определя базовата последователност чрез химическо разцепване на белязаните с 5’ край ДНК фрагменти за предпочитане при всеки от четирите нуклеотида и гел електрофореза. Процедурата за секвениране на Sanger определя нуклеотидната последователност чрез синтезиране на едноверижна ДНК с помощта на ДНК полимераза и дидезоксинуклеотиди и гел електрофореза. Това е ключовата разлика между Maxam Gilbert и Sanger Sequencing.
Какво е Maxam Gilbert Sequencing?
Секвенирането на Maxam Gilbert, известно още като метод на химическо секвениране, е техника, разработена за определяне на реда на нуклеотидите в ДНК. Този метод е въведен от Уолтър Гилбърт и Алън Максам през 1976 г. и става популярен, тъй като може да се извършва директно с пречистена ДНК. Методът на Maxam Gilbert принадлежи към първото поколение секвениране на ДНК и е първият метод за секвениране, използван широко от учените.
Основният принцип на този метод се крие в ограничаването на крайно белязаните ДНК фрагменти при специфични бази чрез специфични за основата химикали и условия и разделянето на белязаните фрагменти чрез електрофореза, както е показано на фигура 01. Фрагментите се разделят според до техните размери върху гела. Тъй като фрагментите са маркирани, последователността на ДНК молекулата може лесно да бъде изведена.
Методът на Maxam Gilbert използва специфични за базата химикали за разбиване на ДНК на специфични бази. Два често срещани химикала, наречени диметилсулфат и хидразин, се използват за селективна атака съответно на пурини и пиримидини.
Методът за секвениране на Maxam Gilbert се извършва чрез няколко стъпки, както следва.
- Пречистване на ДНК последователността с помощта на рестрикционни ендонуклеази
- Етикетиране на краищата на ДНК фрагментите чрез добавяне на радиоактивни фосфати
- Пречистване на белязаните фрагменти от небелязани фрагменти чрез гел електрофореза
- Разделяне на крайната белязана ДНК в четири епруветки и отделно третиране със специфични за основата химикали
- Електрофореза на съдържанието на всяка епруветка на отделни линии върху гел и разделяне на фрагменти според тяхната дължина.
- Откриване на фрагментите чрез авторадиография.
Фигура 01: Секвениране на Максам Гилбърт
Какво е Sanger Sequencing?
Sanger Sequencing е метод за секвениране, разработен от Frederick Sanger и неговите колеги през 1977 г. за определяне на базовата последователност на даден ДНК фрагмент. Известен е също като метод за секвениране на прекъсване на веригата или дидезокси секвениращ метод. Този метод работи на принципа на селективно включване на прекъсващи веригата дидезоксинуклеотиди (ddNTPs) като ddGTP, ddCTP, ddATP и ddTTP от ДНК полимераза по време на синтеза на едноверижна ДНК за прекратяване на образуването на верига. На дидеоксинуклеотидите липсват 3’ ОН групи за образуване на фосфодиестерни връзки със съседен нуклеотид. Следователно образуването на нишка спира, след като ddNTP бъде включен в новообразуващата се нишка по време на секвенирането на Sanger.
При този метод се извършват четири отделни реакции на ДНК синтез (PCR) в четири отделни епруветки с един тип ddNTP. Доставени са и други изисквания за епруветките за PCR, включително праймери, dNTP, Taq полимераза, специфични условия и т.н. Четири отделни реакции се извършват в четири епруветки с четири смеси. След PCR реакции, получените ДНК фрагменти се денатурират топлинно и се разделят чрез гел електрофореза. След това фрагментите се визуализират чрез използване на белязан (радиоактивен или флуоресцентен) праймер или dNTP, както е показано на фигура 02.
Фигура 02: Секвениране на Sanger
Каква е разликата между Maxam Gilbert и Sanger Sequencing?
Maxam Gilbert срещу Sanger Sequencing |
|
| Секвенирането на Maxam Gilbert е първата техника, разработена за секвениране на ДНК. | Методът за секвениране на Сангер е въведен след метода за секвениране на Максам Гилбърт. |
| Употреба | |
| Този метод се използва рядко. | Секвенирането на Sanger се използва рутинно за секвениране. |
| Използване на опасни химикали | |
| Използва опасни химикали. | Използването на опасни химикали е ограничено в сравнение с метода на Максам Гилбърт. |
| Етикетиране за откриване | |
| Този метод използва радиоактивен P32 за маркиране на краищата на ДНК фрагментите. | Секвенирането на Sanger използва радиоактивно или флуоресцентно белязани ddNTP. |
Резюме – Maxam Gilbert срещу Sanger Sequencing
Секвенирането на Maxam Gilbert и Sanger са два вида техники за ДНК секвениране, попадащи в първо поколение ДНК секвениране. Секвенирането на Максам Гилбърт е първият метод, въведен за секвениране на ДНК през 1976 г. и се извършва чрез разчупване на крайно белязаните ДНК фрагменти от специфични за базата химикали. Следователно, това е известно като химическо секвениране. Методът за секвениране на Sanger е въведен през 1977 г. и се основава на реакциите за прекъсване на веригата, управлявани от ddNTP. Методът на секвениране на Сангер е популярен от метода на Максам Гилбърт поради няколко недостатъка на метода на Максам Гилбърт, като прекомерна консумация на време, използване на опасни химикали и др. Това е разликата между секвенирането на Maxam Gilbert и Sanger.
