Ключова разлика – секвениране на Sanger срещу пиросеквениране
Секвенирането на ДНК е много важно за ДНК анализа, тъй като познаването на правилната подредба на нуклеотидите в определена ДНК област разкрива много важна информация за нея. Има различни методи за секвениране на ДНК. Секвенирането на Sanger и пиросеквенирането са два различни метода за секвениране на ДНК, широко използвани в молекулярната биология. Ключовата разлика между секвенирането на Sanger и пиросеквенирането е, че секвенирането на Sanger използва дидезоксинуклеотиди за прекратяване на синтеза на ДНК, за да прочете нуклеотидната последователност, докато пиросеквенирането открива освобождаването на пирофосфат чрез включване на нуклеотидите и синтезиране на допълнителната последователност, за да прочете точния ред на последователността.
Какво е Sanger Sequencing?
Секвенирането на Сангер е метод за секвениране на ДНК от първо поколение, разработен от Фредерик Сангер и неговите колеги през 1977 г. Той е известен също като секвениране с прекъсване на веригата или дидезокси секвениране, тъй като се основава на прекъсване на веригата от дидезоксинуклеотиди (ddNTP). Този метод беше широко използван повече от 30 години, докато не беше разработено секвенирането от ново поколение (NGS). Техниката за секвениране на Sanger позволи откриването на правилния нуклеотиден ред или прикрепването на определен ДНК фрагмент. Основава се на селективното включване на ddNTP и прекратяване на синтеза на ДНК по време на in vitro репликацията на ДНК. Липсата на 3' ОН групи за продължаване на образуването на фосфодиестерна връзка между съседни нуклеотиди е уникална характеристика на ddNTP. Следователно, след като ddNTP е прикрепен, удължаването на веригата престава и завършва от тази точка. Има четири ddNTP – ddATP, ddCTP, ddGTP и ddTTP – използвани в секвенирането на Sanger. Тези нуклеотиди спират процеса на репликация на ДНК, когато се включат в нарастващата верига на ДНК и водят до различни дължини на къса ДНК. Капилярна гел електрофореза се използва за организиране на тези къси ДНК вериги според техните размери върху гел, както е показано на фигура 01.
Фигура 1: Капилярна гел електрофореза на синтезирана къса ДНК
За in vitro репликация на ДНК трябва да се предоставят няколко изисквания. Те са ензим ДНК полимераза, матрична ДНК, олигонуклеотидни праймери и дезоксинуклеотиди (dNTP). При секвенирането на Sanger, репликацията на ДНК се извършва в четири отделни епруветки заедно с четири вида ddNTP поотделно. Дезоксинуклеотидите не са напълно заменени от съответните ddNTP. Смес от конкретния dNTP (например; dATP + ddATP) се включва в епруветката и се репликира. Четири отделни продукта в епруветка се пускат върху гел в четири отделни ямки. След това чрез четене на гела последователността може да бъде конструирана, както е показано на фигура 02.
Фигура 02: Секвениране на Sanger
Секвенирането на Sanger е важна техника, която помага в много области на молекулярната биология. Проектът за човешкия геном беше успешно завършен с помощта на методите, базирани на секвениране на Sanger. Секвенирането на Sanger също е полезно при секвениране на целева ДНК, изследване на рак и генетични заболявания, анализ на генна експресия, човешка идентификация, откриване на патогени, микробно секвениране и др.
Има няколко недостатъка на последователността на Sanger:
- Дължината на секвенираната ДНК не може да бъде по-голяма от 1000 базови двойки
- Може да се секвенира само една нишка наведнъж.
- Процесът отнема време и е скъп.
Следователно с времето бяха разработени нови усъвършенствани техники за секвениране, за да се преодолеят тези проблеми. Секвенирането на Sanger обаче все още се използва поради високоточните резултати до приблизително 850 фрагмента с дължина на базовата двойка.
Какво е пиросеквениране?
Пиросеквенирането е нова техника за секвениране на ДНК, базирана на „секвениране чрез синтез“. Тази техника разчита на откриването на освобождаване на пирофосфат при включването на нуклеотида. Процесът се използва от четири различни ензима: ДНК полимерза, АТФ сулфурилаза, луцифераза и апираза и два субстрата аденозин 5' фосфосулфат (APS) и луциферин.
Процесът започва със свързването на праймера с едноверижната ДНК матрица и ДНК полимеразата започва включването на комплементарни към нея нуклеотиди. Когато нуклеотидите се свържат заедно (полимеризация на нуклеинова киселина), това освобождава пирофосфатни (две фосфатни групи, свързани заедно) групи и енергия. Всяко добавяне на нуклеотид освобождава еквимоларно количество пирофосфат. Пирофосфатът се превръща в АТФ чрез АТФ сулфурилаза в присъствието на субстратен APS. Генерираният АТФ задвижва медиираното от луцифераза превръщане на луциферин в оксилуциферин, произвеждайки видима светлина в количества, които са пропорционални на количеството АТФ. Светлината се открива от устройство за откриване на фотони или от фотоумножител и създава пирограма. Апиразата разгражда АТФ и невключените dNTP в реакционната смес. Добавянето на dNTP се извършва веднъж по едно време. Тъй като добавянето на нуклеотид е известно според включването и откриването на светлина, последователността на матрицата може да бъде определена. Пирограмата се използва за генериране на нуклеотидната последователност на пробата ДНК, както е показано на фигура 03.
Пиросеквенирането е много важно при анализа на единичен нуклеотиден полиморфизъм и секвенирането на къси участъци от ДНК. Високата точност, гъвкавостта, лекотата на автоматизация и паралелната обработка са предимствата на пиросеквенирането пред техниките за секвениране на Sanger.
Фигура 03: Пиросеквениране
Каква е разликата между Sanger секвениране и пиросеквениране?
Секвениране на Sanger срещу пиросеквениране |
|
| Секвенирането на Sanger е метод за секвениране на ДНК, базиран на селективното включване на ddNTP от ДНК полимераза и прекъсване на веригата. | Пиросеквенирането е метод за секвениране на ДНК, базиран на откриването на освобождаване на пирофосфат при включването на нуклеотид. |
| Използване на ddNTP | |
| ddNTP се използват за прекратяване на репликацията на ДНК | ddNTP не се използват. |
| Включени ензими | |
| Използва се ДНК полимераза. | Използват се четири ензима: ДНК полимераза, АТФ сулфурилаза, луцифераза и апираза. |
| Използвани субстрати | |
| APS и Luciferin не се използват. | Използват се аденозин 5' фосфосулфат (APS) и луциферин. |
| Максимална температура | |
| Това е бавен процес. | Това е бърз процес. |
Резюме – секвениране на Sanger срещу пиросеквениране
Секвенирането на Sanger и пиросеквенирането са два метода за секвениране на ДНК, използвани в молекулярната биология. Секвенирането на Sanger изгражда реда на нуклеотидите в последователността чрез прекъсване на удължаването на веригата, докато пиросеквенирането конструира точния ред на нуклеотидите в последователността чрез включване на нуклеотиди и откриване на освобождаването на пирофосфати. Следователно, основната разлика между секвенирането на Sanger и пиросеквенирането е, че секвенирането на Sanger работи върху секвенирането чрез прекъсване на веригата, докато пиросеквенирането работи върху секвенирането чрез синтез.
