Ключова разлика – NGS срещу Sanger Sequencing
Секвениране от следващо поколение (NGS) и секвениране на Sanger са два вида техники за секвениране на нуклеотиди, разработени с времето. Методът на Sanger Sequencing беше широко използван в продължение на много години и NGS го замени наскоро поради неговите предимства. Ключовата разлика между NGS и Sanger Sequencing е, че NGS работи на принципа на секвениране на милиони последователности едновременно по бърз начин чрез система за секвениране, докато Sanger Sequencing работи на принципа на прекъсване на веригата поради селективно включване на дидезоксинуклеотиди от ензима ДНК полимераза по време на репликацията на ДНК и произтичащото от това разделяне на фрагменти чрез капилярна електрофореза.
Какво е нуклеотидно секвениране?
Генетичната информация се съхранява в нуклеотидните последователности на ДНК или РНК на даден организъм. Процесът на определяне на правилния ред на нуклеотидите (с помощта на четири бази) в даден фрагмент (в ген, клъстер от гени, хромозома и пълен геном) е известен като нуклеотидно секвениране. Много е важно в геномните изследвания, криминалистичните изследвания, вирусологията, биологичната систематика, медицинската диагностика, биотехнологиите и в много други области да се анализира структурата и функцията на гените. Има различни видове методи за секвениране, разработени от учени. Сред тях секвенирането на Sanger, разработено от Frederick Sanger през 1977 г., беше широко използвано и популяризирано за дълъг период от време, докато секвенирането от следващо поколение не го замени.
Какво е NGS?
Секвениране от следващо поколение (NGS) е термин, използван за обозначаване на модерни процеси за секвениране с висока пропускателна способност. Той описва редица различни съвременни технологии за секвениране, които революционизират геномните изследвания и молекулярната биология. Тези техники са секвениране на Illumina, секвениране на Roche 454, секвениране на йонни протони и SOLiD (секвениране чрез откриване на олиголигиране) секвениране. NGS системите са по-бързи и по-евтини. В NGS системите се използват четири основни метода за секвениране на ДНК, а именно; пиросеквениране, секвениране чрез синтез, секвениране чрез лигиране и йонно полупроводниково секвениране. Голям брой ДНК или РНК вериги (милиони) могат да бъдат секвенирани паралелно. То позволява секвениране на целия геном на организмите за кратък период от време, за разлика от секвенирането на Sanger, което отнема повече време.
NGS има много предимства пред конвенционалния метод на Sanger за секвениране. Това е високоскоростен, по-точен и рентабилен процес, който може да се извърши с малък размер на извадката. NGS може да се използва в метагеномни изследвания, при откриване на вариации в индивидуален геном, дължащи се на вмъквания и делеции и т.н., и при анализ на генни експресии.
Фигура_1: Развитие в секвенирането на NGS
Какво е Sanger Sequencing?
Sanger Sequencing е метод за секвениране, разработен от Фредерик Сангер и колегите му през 1977 г. за определяне на точния нуклеотиден ред на даден ДНК фрагмент. Известно е също като секвениране при прекъсване на веригата или дидезокси секвениране. Принципът на работа на този метод е прекратяването на синтеза на верига чрез селективно включване на верига, завършваща дидезоксинуклеотиди (ddNTPs) като ddGTP, ddCTP, ddATP и ddTTP от ДНК полимераза по време на репликацията на ДНК. Нормалните нуклеотиди имат 3’ ОН групи за образуване на фосфодиестерна връзка между съседни нуклеотиди, за да продължи образуването на нишка. Въпреки това, ddNTPs нямат тази 3' OH група и не са в състояние да образуват фосфодиестерни връзки между нуклеотидите. Следователно удължаването на веригата е прекратено.
При този метод едноверижната ДНК, която трябва да бъде секвенирана, служи като шаблонна верига за ин витро синтез на ДНК. Други изисквания са олигонуклеотиден праймер, дезоксинуклеотидни прекурсори и ензим ДНК полимераза. Когато страничните краища на целевия фрагмент са известни, праймерите могат лесно да бъдат проектирани за репликация на ДНК. Четири отделни реакции на ДНК синтез се извършват в четири отделни епруветки. Всяка тръба има отделни ddNTP, заедно с други изисквания. От конкретния нуклеотид се добавя смес от dNTP и ddNTP. По същия начин се извършват четири отделни реакции в четири епруветки с четири смеси. След реакциите се извършва откриване на ДНК фрагменти и преобразуване на шаблона на фрагмента в информация за последователността. Получените ДНК фрагменти се денатурират топлинно и се разделят чрез гел електрофореза. Ако се използват радиоактивни нуклеотиди, моделът на ивици в полиакриламидния гел може да се визуализира чрез авторадиография. Когато този метод използва флуоресцентно маркирани дидезоксинуклеотиди, той може да бъде смекчен надолу по четенето на гела и прекаран през лазерен лъч, за да бъде открит от флуоресцентния детектор. За да се избегнат грешки, които могат да възникнат, когато последователност се чете от окото и се въвежда ръчно в компютър, този метод се разви в използването на автоматизиран секвенсер, свързан с компютъра.
Това е методът, използван за секвениране на ДНК от проекта за човешкия геном. Този метод все още се използва с разширени модификации, защото дава точна информация за последователността, въпреки че е скъп и бавен процес.
Фигура_2: Секвениране на Sanger
Каква е разликата между NGS и Sanger Sequencing?
NGS срещу Sanger Sequencing |
|
| Секвенирането от следващо поколение (NGS) се отнася до модерни процеси за секвениране с висока производителност. Той описва редица различни съвременни технологии за секвениране | Секвенирането на Сангер е метод за секвениране, разработен от Фредерик Сангер за определяне на точния нуклеотиден ред на даден ДНК фрагмент. |
| Ефективност на разходите | |
| NGS е по-евтин процес, тъй като намалява времето, работната сила и химикалите. | Това е скъп процес, защото отнема време, човешка сила и повече химикали. |
| Скорост | |
| Това е по-бързо, тъй като както химическото откриване, така и откриването на сигнала на много вериги се случват успоредно. | Това отнема много време, тъй като откриването на химикали и откриването на сигнали се случват като два отделни процеса и само на нишка може да се чете едновременно. |
| Надеждност | |
| NGS е надежден. | Секвенирането на Sanger е по-малко надеждно |
| Размер на извадката | |
| NGS изисква по-малко количество ДНК. | Този метод се нуждае от голямо количество шаблонна ДНК. |
| ДНК бази на секвениран фрагмент | |
| Броят на ДНК базите на секвениран фрагмент е по-нисък от метода на Sanger | Генериращите последователности са по-дълги от NGS последователностите. |
Резюме – NGS срещу Sanger Sequencing
NGS и Sanger Sequencing са техники за секвениране на нуклеотиди, използвани широко в молекулярната биология. Секвенирането по Sanger е ранен метод за секвениране, който беше заменен от NGS. Основната разлика между NGS и Sanger Sequencing е, че NGS е високоскоростен, по-точен и рентабилен процес от Sanger Sequencing. И двете техники създадоха големи епидемии в генетиката и биотехнологиите.
