Ключова разлика – клониране на ген срещу PCR
Синтезът на много копия на ДНК от специфичен ДНК фрагмент се нарича ДНК амплификация. Има два основни процеса на усилване на ДНК, а именно генно клониране и PCR. Ключовата разлика между генното клониране и PCR е, че генното клониране произвежда множество копия на специфичен ген in vivo чрез конструиране на рекомбинантна ДНК и отглеждане в бактерия гостоприемник, докато PCR произвежда милиони копия на специфичен ДНК фрагмент in vitro, подложен на повтарящи се цикли на денатурация и синтез.
Какво е генно клониране?
Генното клониране е техника, използвана за локализиране и умножаване на специфичен ген от извлечената геномна ДНК на организъм чрез изграждане на рекомбинантна ДНК. Геномната ДНК съдържа хиляди различни гени, кодирани за протеини. Когато се извлече ДНК, тя включва всички възможни гени, които може да носи. Техниката за клониране на гени е позволила откриването на специфичен ген от цялата ДНК. Следователно генното клониране служи като важен инструмент в молекулярната биология.
Създаването на геномна библиотека на организъм е от съществено значение при генното клониране, ако няма представа за местоположението на съответния ген в ДНК. Геномна библиотека се прави чрез следните стъпки.
Стъпка 1: Извличане на цялата ДНК от организъм, който съдържа желания ген.
Стъпка 2: Ограничаване на смилането на извлечената ДНК за получаване на малки управляеми фрагменти. Тази стъпка се улеснява от рестрикционни ендонуклеази.
Стъпка 3: Избор на подходящ вектор и отваряне на векторната ДНК с помощта на същите рестрикционни ендонуклеази. Бактериалните плазмиди обикновено се използват като вектори за пренасяне на чужда ДНК. Плазмидите са малки кръгове от ДНК, разположени в бактерии.
Стъпка 4: Комбиниране на векторна ДНК и фрагментирана ДНК за получаване на рекомбинантна ДНК молекула. Тази стъпка се управлява от ДНК лигаза.
Стъпка 5: Прехвърляне на рекомбинантни ДНК молекули в приемни бактерии. Тази стъпка е известна като трансформация и се извършва с помощта на топлинен шок.
Стъпка 5: Скрининг на трансформирани бактериални клетки върху културална среда. Смесена популация от трансформирани и нетрансформирани гостоприемни клетки се получава в края на процеса на трансформация. Тъй като представляващият интерес ген включва само в трансформирани гостоприемни клетки. Следователно е необходимо да се изберат трансформирани клетки. Селекцията се извършва с помощта на селективна среда, която съдържа антибиотици. Само трансформираните клетки растат върху тази среда за скрининг, позволявайки селекцията.
Стъпка 6: Отглеждане на бактерии за производство на генна библиотека. В този етап трансформираните гостоприемни клетки се въвеждат в прясна културална среда, която осигурява оптимални изисквания за растеж. Общият брой колонии в плочките с култура представляват геномната библиотека на този организъм.
Стъпка 7: Рекомбинантната ДНК молекула, съдържаща интересния ген, трябва да бъде скринирана от хиляди клонирани фрагменти от рекомбинантна ДНК. Може да се постигне чрез използване на сонди, които маркират специфичния ген или специфичния протеин, получен от този ген.
След като заинтересованият ген, съдържащ бактериалната колония, бъде идентифициран от общия брой колонии, е възможно да се направят милиони копия на рекомбинантния плазмид, който съдържа гена.
Генното клониране се използва за създаване на генни библиотеки, производство на специални протеини, витамини, антибиотици, хормони, секвениране и картографиране на геноми на организми, създаване на множество копия на индивидуална ДНК в криминалистиката и др.
Фигура_1: Клониране на ген
Какво е PCR?
Полимеразната верижна реакция (PCR) е техника, която генерира голям брой копия на определен ДНК фрагмент. Експоненциална амплификация на специфична ДНК последователност се получава чрез PCR при in vitro условия. Тази техника е много мощен инструмент в молекулярната биология, тъй като може да умножи малка проба от ДНК в използваемо количество. PCR е въведена от Kary Mullis през 1983 г. и това наградено изобретение създава огромен напредък в молекулярната биология.
PCR техниката следва повтарящи се PCR реакции, както е показано на Фигура 02. Една PCR реакция се състои от три основни стъпки, протичащи при три различни температури; денатуриране на двойноверижна ДНК при 94 0C, отгряване на праймери при 68 0C и удължаване на веригата при 72 0 C. Следователно, когато се извършва PCR, температурните колебания трябва да бъдат силно поддържани за правилна репликация. PCR се извършва в PCR машина в PCR епруветки. PCR епруветките се зареждат с правилни PCR смеси, съдържащи матрична ДНК, Taq полимераза, праймери, dNTPs и буфер. Денатурирането на двойноверижна проба ДНК в едноверижна ДНК се извършва чрез разкъсване на водородните връзки между комплементарни бази при 94 – 98 0C. След това единични вериги от матрична ДНК се експонират за праймери. Трябва да се осигурят чифт праймери (преден и обратен) и те трябва да бъдат термостабилни, за да понасят високи температури. Праймерите са едноверижни къси ДНК последователности, комплементарни на краищата на целевия ДНК фрагмент. При PCR се използват синтетични праймери. Праймерите се свързват с комплементарните бази на пробата ДНК и инициират синтеза на нова верига. Тази стъпка се катализира от ензим, наречен Taq полимераза; термостабилен ензим ДНК полимераза, изолиран от Thermus auqaticus. Когато са налични праймери и нуклеотиди (изграждащи елементи), Taq полимеразата конструира новата верига на ДНК, комплементарна на матричната ДНК. В края на PCR програмата се наблюдава амплифициран ДНК фрагмент с помощта на гел електрофореза. Ако е необходим допълнителен анализ, PCR продуктът се пречиства от гела.
PCR е много полезен за диагностициране и наблюдение на генетични и придобити заболявания, идентифициране на престъпници (в областта на криминалистиката), изследване на структурата и функцията на целеви сегмент от ДНК, секвениране и картографиране на геноми на организми, и т.н. PCR се е превърнала в рутинна лабораторна техника в лабораториите за изследване на медицината и молекулярната биология сред учените, тъй като има голямо разнообразие от приложения.
Фигура_2: Полимеразна верижна реакция
Каква е разликата между генно клониране и PCR?
Клониране на ген срещу PCR |
|
| Генното клониране е процес на създаване на множество копия на специфичен ген in vivo чрез рекомбинантна ДНК и трансформиране в бактерия гостоприемник. | PCR техниката произвежда множество копия на определена ДНК последователност in vitro чрез повтарящи се цикли на PCR реакции. |
| Изискване за конструиране на рекомбинантна ДНК | |
| Произвежда се рекомбинантна ДНК, за да се локализира генът. | Не се произвежда рекомбинантна ДНК. |
| Нужда от работа | |
| Този процес е трудоемък. | Не е необходимо интензивно раждане. |
| In vivo или ин витро процес | |
| Конструкцията на рекомбинантна ДНК е in vitro, а амплификацията на ДНК е in vivo. | Амплификацията на ДНК се случва изцяло in vitro. |
Резюме – Генно клониране срещу PCR
Генното клониране и PCR са два метода, използвани за амплификация на ДНК. PCR е in vitro процес, който прави множество копия на ДНК на определен ДНК фрагмент, без да се използва рекомбинантна ДНК и организъм гостоприемник. Генното клониране е предимно in vivo процес, който води до множество копия на заинтересован ген в организма на гостоприемника чрез изграждане на рекомбинантна ДНК. Това е разликата между клонирането на гени и PCR.
