Ключова разлика – PCR срещу секвениране на ДНК
PCR и секвенирането на ДНК са две важни техники в молекулярната биология. Полимеразна верижна реакция (PCR) е процес, който създава голям брой копия на ДНК фрагмент. ДНК секвенирането е техниката, която води до точния ред на нуклеотидите на даден ДНК фрагмент. Това е ключовата разлика между PCR и ДНК секвенирането. PCR е една от основните стъпки в секвенирането на ДНК.
Какво е PCR?
Полимеразната верижна реакция (PCR) е техника за усилване на ДНК, използвана в молекулярната биология. Той произвежда хиляди до милиони копия на определен ДНК фрагмент. Този метод е разработен от Kary Mullis през 1983 г. При тази техника фрагментът от ДНК, който трябва да бъде амплифициран, служи като шаблон, а ензимът ДНК полимераза добавя допълнителни нуклеотиди към праймера, който е наличен в PCR сместа. В края на PCR реакцията се синтезират много копия на пробата ДНК.
Има различни компоненти на PCR сместа, включително ДНК, ДНК полимераза (Taq полимераза), праймери (прави и обратни праймери), нуклеотиди (градивни елементи на ДНК) и буфер. PCR се случва вътре в PCR машина и правилната PCR смес трябва да бъде заредена в машината и трябва да се управлява правилната програма. Тази техника позволява производството на хиляди до милиони копия на определен участък от ДНК от много малко количество ДНК.
PCR реакциите протичат по цикличен начин, за да се получи видимото количество PCR продукти върху гел. Има три основни стъпки, включени в PCR реакцията, а именно денатурация, отгряване на праймера и удължаване на веригата, както е показано на фигура 01. Тези три стъпки се случват при три различни температури. ДНК съществува в двойноверижна форма чрез водородни връзки между комплементарните бази. Преди импликацията двойноверижната ДНК трябва да бъде отделена една от друга. Извършва се чрез подаване на висока температура. При висока температура двойноверижната ДНК денатурира в единични вериги. След това праймерите трябва да се доближат до страничните краища на специфичния фрагмент или гена на ДНК. Праймерът е къса част от едноверижна ДНК, която е комплементарна на целевата последователност. Правите и обратните праймери се отгряват с комплементарните бази в страничните краища на денатурираната проба ДНК при температурата на отгряване. Грундовете трябва да са топлоустойчиви. След като праймерите се свържат с ДНК на пробата, ензимът taq полимераза инициира синтеза на новите вериги чрез добавяне на нуклеотиди, които са комплементарни на целевата ДНК. Taq полимеразата е термостабилен ензим, изолиран от термофилна бактерия, наречена Thermus aquaticus. PCR буферът поддържа оптималните условия за действието на taq полимераза. Тези три етапа на PCR реакции се повтарят, за да се получи необходимото количество PCR продукт. След всяка PCR реакция броят на ДНК копието се удвоява. Следователно при PCR може да се наблюдава експоненциално усилване. PCR продуктите могат да бъдат наблюдавани с помощта на гел електрофореза и могат да бъдат пречистени за по-нататъшни изследвания.
Фигура 01: Основни стъпки на PCR реакция
PCR е ценен инструмент в медицинските и биологични изследвания. PCR има специална стойност в съдебната медицина, тъй като може да амплифицира ДНК за изследвания от малки проби от престъпниците и да направи съдебномедицински ДНК профили. PCR се използва широко в много области на молекулярната биология, включително генотипиране, генно клониране, откриване на мутации, ДНК секвениране, ДНК микрочипове и тестове за бащинство и др.
Фигура 02: Полимеразна верижна реакция
Какво е секвениране на ДНК?
ДНК секвенирането е определянето на точен ред на нуклеотидите – аденин, гуанин, цитозин и тимин в даден ДНК фрагмент. Генетичната информация се съхранява в ДНК последователностите, като се използва правилният ред на нуклеотидите. Следователно намирането на точния ред на нуклеотидите в ДНК фрагмент е много важно да се знае за структурата и функцията на гените.
Протоколът за секвениране на ДНК включва различни процеси. Първата стъпка е изолирането на интересуващата се ДНК или геномна ДНК на организъм. Използвайки PCR (както е описано по-горе), желаният регион на ДНК трябва да бъде амплифициран. Амплифицираният PCR продукт трябва да бъде отделен чрез гел електрофореза и пречистен. Амплифицираните фрагменти се служат като шаблони за секвениране. Секвенирането може да се извърши или чрез секвениране на Sanger, или чрез високопроизводителен метод на секвениране. Секвенирането по Sanger изисква капилярна електрофореза на получените ДНК фрагменти. Определянето на правилния ред на нуклеотидите може да се направи чрез ръчно четене на авторадиографи или използване на автоматизирани ДНК секвенатори.
Генното секвениране допринесе за проекта за човешкия геном и улесни картографирането на човешкия геном през 2003 г. В съдебната медицина секвенирането на ДНК даде възможност за идентифициране на индивиди, които показват уникални ДНК последователности и идентифициране на престъпниците. В медицината секвенирането на ДНК може да се използва за откриване на гените, отговорни за генетични и други заболявания, намиране на дефектни гени и замяната им с правилни гени. В селското стопанство информацията за секвениране на ДНК на някои микроорганизми се използва за производство на трансгенни култури с икономически желани характеристики.
Фигура 03: Секвениране на ДНК
Каква е разликата между PCR и ДНК секвениране?
PCR срещу секвениране на ДНК |
|
| PCR процесът създава хиляди до милиони копия на интересуващия се ДНК фрагмент. | Секвенирането на ДНК е процес на определяне на точния ред на нуклеотидите в даден ДНК фрагмент. |
| Резултат | |
| PCR създава хиляди до милиони копия на определен ДНК фрагмент | Това води до правилния ред на базите в определен ДНК фрагмент. |
| Участие на ddNTPs | |
| PCR не изисква ddNTP. Използва dNTPs. | Секвенирането на ДНК изисква ddNTP, за да прекрати образуването на нишка. |
Резюме – PCR срещу секвениране на ДНК
PCR и секвенирането на ДНК са много важни инструменти в много области на молекулярната биология. Амплификацията на ДНК фрагментите се извършва чрез PCR техника, докато правилният ред на нуклеотидите на ДНК фрагмент се определя от ДНК секвенирането. Това е разликата между PCR и секвенирането на ДНК.
