Ключова разлика – RT PCR срещу QPCR
Полимеразната верижна реакция е техника, използвана за амплифициране на специфичен регион на ДНК in vitro. Благодарение на изобретяването на тази техника от Кари Мълис през 1983 г., учените са в състояние да направят хиляди до милиони копия на специфични ДНК фрагменти за изследователски цели. Понастоящем това се е превърнало в обичайна и рутинно прилагана техника в клинични и изследователски лаборатории за голямо разнообразие от приложения. Има варианти на традиционната PCR техника като RT PCR, вложена PCR, мултиплексна PCR, Q PCR, RT – QPCR и т.н. RT PCR и Q PCR са два важни варианта на PCR. Ключовата разлика между RT PCR и Q PCR е, че RT PCR се използва за откриване на генна експресия чрез създаване на комплементарни ДНК (cDNA) транскрипти от РНК, докато Q PCR се използва за количествено измерване на PCR продуктите в реално време с помощта на флуоресцентни багрила.
Какво е RT PCR?
Полимеразна верижна реакция с обратна транскрипция (RT PCR) е вариант на PCR, който се използва за откриване на РНК експресия. Това е много важен метод за откриване на експресията на иРНК в тъканите. RT PCR се използва, когато изходният материал на пробата е РНК. При RT PCR матричната иРНК първо се превръща в комплементарна ДНК. Тази стъпка се катализира от ензима обратна транскриптаза и процесът е известен като обратна транскрипция. Второ, традиционната PCR се използва за новосинтезираната cDNA за амплификация.
RT PCR е високочувствителна техника, която изисква сравнително малко количество РНК проба. RT PCR обикновено се използва при диагностицирането и количественото определяне на РНК видове, особено РНК вируси като човешки имунодефицитен вирус и вирус на хепатит С.
Фигура 01: Техника на RT PCR
Какво е QPCR?
Количествената PCR (QPCR) е вариант на PCR, който се използва за количествено измерване на PCR продуктите. Нарича се още полимеразна верижна реакция в реално време, тъй като измерва амплификацията в реално време с помощта на PCR машина в реално време. Това е подходящ метод за определяне на количеството на целева последователност или ген, присъстващи в проба. Интересната характеристика на QPCR е, че комбинира както усилване, така и истинско количествено определяне в една стъпка. Следователно необходимостта от гел електрофореза при откриване може да бъде елиминирана чрез QPCR техника. QPCR използва флуоресцентни багрила за маркиране на PCR продукти по време на PCR реакциите, които в крайна сметка водят до директно количествено определяне. Когато PCR продуктите се натрупат, флуоресцентните сигнали също се натрупват и това ще бъде измерено от машината в реално време. QPCR може да се комбинира с RT PCR. Известен е като RT – QPCR или QRT – PCR и се счита за най-мощния, чувствителен и количествен метод за откриване на нивата на РНК в клетките или тъканите.
SYBR Green и Taqman са два метода, използвани за откриване или наблюдение на процеса на амплификация на PCR в реално време. Методът SYBR Green се извършва с помощта на флуоресцентно багрило, наречено SYBR green, и открива амплификацията чрез свързване на багрилото за получаване на двойноверижна ДНК. Taqman се извършва с помощта на двойно белязани сонди и открива амплификацията чрез разграждане на сондата от Taq полимераза и освобождаване на флуорофора, както е показано на фигура 02. И двата метода наблюдават напредъка на процеса на амплификация и отчитат количеството на продукта в реално време.
PCR в реално време има голямо разнообразие от приложения като количествено определяне на генната експресия, анализ на микроРНК и некодираща РНК, SNP генотипиране, откриване на варианти на брой копия, откриване на редки мутации, откриване на генетично модифицирани организми, откриване на инфекциозни агенти и др.
Фигура 02: Количествена PCR техника
Каква е разликата между RT PCR и QPCR?
RT PCR срещу QPCR |
|
| RT PCR е техника, използвана за откриване на генна експресия чрез амплификация. | QPCR е техника, която амплифицира ДНК и количествено определя PCR продуктите в реално време. |
| Участие на ензима обратна транскриптаза | |
| Ензимната обратна транскриптаза се използва за RT PCR. | Ензимната обратна транскриптаза не се използва за QPCR. |
| Използване на флуоресцентно маркирани молекули | |
| Флуоресцентно маркирани багрила или сонди не се използват за RT PCR. | Флуоресцентно маркирани багрила или сонди се използват за QPCR. |
| Количествено определяне на PCR продукт | |
| Освен ако не е свързан с QPCR, RT PCR не определя количествено PCR продукта. | QPCR количествено измерване на PCR продукта. |
| Изходен материал | |
| Изходният материал е иРНК. | Изходният материал е ДНК. |
| Синтез на cDNA | |
| По време на RT PCR се произвежда допълнителна ДНК. | Допълнителна ДНК не се произвежда по време на QPCR. |
Обобщение – RT PCR срещу QPCR
RT PCR и QPCR са две версии на традиционния PCR. Техниката RT PCR се извършва за иРНК проби и се задвижва от обратна транскрипция и производство на кДНК. QPCR се използва за количествено определяне на PCR продукти по време на PCR термични цикли в реално време с помощта на флуоресцентни багрила или маркирани сонди. При QPCR количеството PCR продукт се представя от излъчваните флуоресцентни сигнали от пробата. RT PCR се използва широко като процес на амплификация, докато QPCR обикновено се използва като процес на количествено определяне. Това е разликата между RT PCR и QPCR.
