Ключовата разлика между конвенционалните вложени PCR и в реално време PCR анализи е, че конвенционалната PCR е техника, разработена за амплифициране на специфични последователности на ДНК, а вложената PCR е модификация на конвенционалната PCR, която се състои от две последователни реакции на усилване, докато реалната -time PCR е вариант на конвенционалната PCR, която е в състояние да определи количествено амплифицирания продукт.
PCR е много разпространена научна техника, широко използвана в изследванията и медицината за откриване на ДНК. PCR тестовете се използват за откриване на антигени чрез откриване на тяхната ДНК или РНК. Обикновено вирусната РНК присъства в тялото, преди да открие антитела или да покаже симптомите на заболяването. PCR тестът може да разбере дали някой има вируса или не на ранен етап. В момента PCR е стандартният тест за откриване на заболяването COVID-19. Има различни видове PCR техники като PCR в реално време, вложена PCR, мултиплексна PCR, PCR с горещ старт и PCR на далечни разстояния и др.
Какво представляват конвенционалните PCR анализи?
Конвенционалният PCR анализ е in vitro техника за амплификация на ДНК, която се извършва рутинно в молекулярно-биологични лаборатории. Този метод позволи производството на хиляди до милиони копия на определен ДНК фрагмент. Кари Мълис въвежда тази техника през 1980 г. Тази техника изисква ДНК фрагмент, известен като шаблон, за да се направят много копия от него. Taq полимеразата работи като ензим ДНК полимераза и катализира синтеза на нови вериги на шаблонната последователност.
Праймерите в PCR сместа ще работят като отправни точки за разширенията на фрагментите. Всички съставки, необходими за създаване на копия на ДНК, са включени в PCR сместа. PCR реакцията се провежда в PCR машина и трябва да се захранва с правилната PCR смес и правилната PCR програма. Ако реакционната смес и програмата са правилни, тя ще произведе необходимия брой копия на определен участък от ДНК от много малко количество ДНК.
Фигура 01: Конвенционален PCR анализ
Има три основни стъпки, включени в PCR реакцията: денатурация, отгряване на праймера и удължаване на веригата. Тези три стъпки се случват при три различни температури. PCR буферът поддържа оптималните условия за Taq полимеразното действие. Тези три етапа на PCR реакцията се повтарят, за да се получи необходимото количество от PCR продукта. При всяка PCR реакция броят на ДНК копията се удвоява. Следователно, при PCR може да се наблюдава експоненциално усилване. PCR продуктът може да бъде разделен с помощта на гел електрофореза, тъй като произвежда видимо количество ДНК върху гел и може да бъде пречистен за по-нататъшни изследвания, като например секвениране.
PCR е ценен инструмент в медицинските и биологични изследвания. Особено в криминалистичните изследвания PCR има огромна стойност, тъй като може да амплифицира ДНК за изследвания от малки проби на престъпниците и да направи съдебномедицински ДНК профили. PCR се използва широко в много области на молекулярната биология, включително генотипизиране, генно клониране, откриване на мутации, ДНК секвениране, ДНК микрочипове и тестове за бащинство.
Какво представляват вложените PCR анализи?
Вложената PCR е вид PCR, който намалява неспецифичната амплификация на ДНК. Има две последователни PCRs или две последователни реакции на амплификация в вложен PCR анализ. По време на първата реакция на амплификация се получава PCR продукт. След първата реакция се извършва втора реакция на амплификация на PCR продукта от първата реакция. Следователно праймерите във втората реакционна смес се свързват с първия PCR продукт и го амплифицират.
Фигура 02: Вложена PCR
Двойките праймери са различни във всяка реакция. Неспецифичното свързване на праймерите е намалено при вложена PCR. Вложените PCR анализи са полезни за повишаване на чувствителността и/или специфичността. Въпреки това, вложената PCR изисква познания за интересуващата се последователност.
Какво представляват PCR анализите в реално време?
PCR в реално време или количествена PCR (Q PCR) е модифицирана версия на PCR, която измерва PCR продуктите количествено. Следователно тази техника определя количествено амплификацията в реално време с помощта на PCR машина в реално време. Също така е подходящ метод за определяне на количеството на целева последователност или ген, присъстващ в проба.
Интересната характеристика на PCR в реално време е, че комбинира както амплификация, така и истинско количествено определяне в една стъпка. Следователно необходимостта от гел електрофореза за откриване може да бъде елиминирана чрез PCR техниката в реално време. Използването на флуоресцентни багрила за маркиране на PCR продукти по време на PCR реакциите в крайна сметка ще доведе до директно количествено определяне. Когато PCR продуктите се натрупат, флуоресцентните сигнали също се натрупват и те ще бъдат измерени от машината в реално време. SYBR Green и Taqman са два метода за откриване или наблюдение на процеса на амплификация на PCR в реално време. И двата метода наблюдават напредъка на процеса на усилване и отчитат количеството на продукта в реално време.
Фигура 03: PCR в реално време
PCR в реално време има голямо разнообразие от приложения като количествено определяне на генната експресия, анализ на микроРНК и некодираща РНК, SNP генотипиране, откриване на варианти на брой копия, откриване на редки мутации, откриване на генетично модифицирани организми и откриване на инфекциозни агенти.
Какви са приликите между конвенционалните вложени и PCR анализи в реално време?
- Вложените PCR анализи и PCR анализи в реално време са модификации на конвенционалния PCR анализ.
- И трите техники усилват ДНК проби.
- Техните продукти могат да се използват при секвениране или анализ.
- Тези анализи изискват праймери.
Каква е разликата между конвенционалните вложени и PCR анализи в реално време?
Конвенционалната PCR е техника, разработена за амплифициране на специфични последователности на ДНК. Междувременно Nested PCR е модификация на конвенционалната PCR, която се състои от две последователни реакции на амплификация, а PCR в реално време е вариант на конвенционалната PCR, която е в състояние да определи количествено амплифицирания продукт. И така, това е ключовата разлика между конвенционалните вложени и PCR анализи в реално време. За разлика от конвенционалната PCR и PCR в реално време, вложената PCR използва два комплекта праймери. Освен това има две последователни реакции на амплификация в вложената PCR, за да се намали неспецифичната амплификация. освен това конвенционалните и PCR анализите в реално време не съдържат две последователни реакции на амплификация.
Следващата инфографика изброява разликите между конвенционалните вложени и PCR анализи в реално време в таблична форма за сравнение едно до друго.
Обобщение – конвенционални срещу вложени срещу PCR анализи в реално време
Конвенционалната PCR е първата техника, разработена за амплифициране на специфични фрагменти от ДНК. Вложената PCR и PCR в реално време са два варианта на конвенционалната PCR. Има две последователни реакции на амплификация и използването на два комплекта праймери в вложена PCR. PCR в реално време е разработен за количествено определяне на амплифицирания PCR продукт. По този начин това обобщава разликата между конвенционалните вложени и PCR анализи в реално време.
