Ключова разлика – лигиране с тъп срещу лепкав край
Рестрикционните ендонуклеази са специфични ензими, които разрязват двойноверижна ДНК (dsDNA). Те са известни също като молекулярни ножици в молекулярната биология. Рестрикционните ензими са способни да разпознават специфични къси последователности на dsDNA, известни като места за разпознаване, и разцепват фосфодиестерни и водородни връзки, за да отворят двойни вериги. В резултат на разцепването от тези ензими се получават ДНК фрагменти с различни видове краища, като лепкави краища и тъпи краища. ДНК лигазата е ензим, използван в молекулярната биология за свързване на две съседни вериги на ДНК чрез образуване на нови връзки. Стъпката е известна като лигиране и според вида на лигирания край на ДНК те могат да бъдат посочени като лигиране с тъп край и лигиране с лепкав край. Ключовата разлика между лигирането с тъп и лепкав край е, че лигирането с тъп край се случва между ДНК фрагменти, които съдържат два тъпи края, докато лигирането с лепкав край се случва между 5' и 3' надвеси. В сравнение с лигирането с тъп край, лигирането с лепкав край е по-ефективно и стабилно.
Какво е лигиране с тъп край?
Някои рестрикционни ендонуклеази могат да разрежат ДНК в противоположните основи и да произведат ДНК фрагменти с тъпи краища. Тези ензими са известни като ножове с тъп край; те се разцепват право надолу до средата на рестрикционното място, без да оставят едноверижни надвиснали основи. Тъпите краища са известни също като ненадвиснали краища, тъй като нямат 3' и 5' надвиснали основи в краищата. И двете нишки завършват от базовите двойки в тъпи краища. Обичайните режещи ензими с тъп край са EcoRV HaeIII, AluI и SmaI.
Лигирането с тъп край е включено между два тъпи края. Не е лигиране на изпъкнали основи. Това лигиране е по-малко ефективно от лигирането с лепкав край. Въпреки това, в някои случаи лигирането с тъп край става по-изгодно от лигирането с лепкав край, особено когато се лигират PCR продукти. PCR продуктите винаги се произвеждат с тъпи краища. Лигирането с тъп край не изисква допълнителни краища в ДНК за лигирането.
Фигура 01: Производство на тъп край от Eco RV ензима
Какво е лепкава крайна лигатура?
Някои рестрикционни ендонуклеази са способни да режат dsDNA, оставяйки надвиснала част от едноверижна ДНК в края. Тези краища са известни като лепкави или надвиснали краища. Свързването на лепкавия край възниква между два ДНК фрагмента, които съдържат съвпадащи надвеси, тъй като лепкавите краища са притежавани от несдвоени бази и изискват допълващи се бази, за да образуват връзки. Следователно е необходимо да се използва един и същ рестрикционен ензим и за двата източника на ДНК, за да се произведат съвпадащите лигиращи фрагменти.
Лигирането на лепкавия край е по-ефективно и често е много желателно в процесите на клониране. Има няколко рестрикционни ензима, които произвеждат лепкави краища. Те са EcoRI, BamHI, HindIII и др.
Фигура 02: Производство на лепкав край от ензима Eco RI
Каква е разликата между лигиране с тъп и лепкав край?
Лигиране на тъп срещу лепкав край |
|
| Лигиране с тъп край възниква между два ДНК фрагмента с тъп край. | Свързването на лепкавия край възниква между два съвпадащи ДНК фрагмента с лепкави краища. |
| Ензими | |
| Резачите с тъпи краища създават тъпи краища. | Резачките за лепкави краища създават лепкави или кохезивни краища. |
| Изискване за съвпадащи краища | |
| Не изисква съответстващи фрагменти или допълващи се бази. | Необходими са допълнителни бази в краищата, за да се образуват базови двойки. |
| Ефективност | |
| То е по-малко ефективно от лигирането с лепкав край | По-ефективно е от лигирането с тъп край. |
Обобщение – Лигиране с тъп срещу лепкав край
Рестрикционните ендонуклеази са способни да разцепват dsDNA и да произвеждат ДНК фрагменти с различни краища. Те разпознават специфични последователности и ограничават ДНК, създавайки лепкави и тъпи краища. Лепкавите краища имат несдвоени основи в края на фрагментите. Тъпите краища се създават поради право разцепване и имат двойки основи в краищата. Лигирането на лепкавия край изисква две допълващи се едноверижни ДНК части. Свързване с тъп край възниква между всеки два фрагмента с тъп край. Това е разликата между тъпото и лепкавото лигиране.
