Ключова разлика – Nick Translation срещу Primer Extension
Преводът на Ник и удължаването на праймера са две важни техники, изпълнявани в молекулярната биология. Ключовата разлика между ник транслация и удължаване на праймера е, че процесът на ник транслация произвежда белязани сонди за други техники на хибридизация, докато методът на удължаване на праймера идентифицира специфична РНК последователност от смес и разкрива информация за експресията на иРНК. И двете техники са от голямо значение и се извършват рутинно в лаборатории за молекулярни изследвания.
Какво е Nick Translation?
Преводът на Ник е важна техника, използвана за приготвяне на маркирани сонди за различни молекулярно-биологични техники като блотиране, in situ хибридизация, флуоресцентна in situ хибридизация и др. Това е in vitro метод за маркиране на ДНК. ДНК сондите се използват за идентифициране на специфични ДНК или РНК последователности. С помощта на белязана сонда специфични фрагменти могат да бъдат маркирани или визуализирани от сложна смес от нуклеинова киселина. Следователно, белязаните проби се приготвят с помощта на различни техники, за да се използват за различни техники. Преводът на Ник е един такъв метод, който произвежда белязани сонди с помощта на ензими ДНКаза 1 и ДНК полимераза 1.
Процесът на превод на ник започва с ензимната активност на DNase 1. DNase 1 въвежда прорези във фосфатния скелет на двойноверижна ДНК чрез разцепване на фосфодиестерни връзки между нуклеотидите. След като никът бъде създаден, свободната 3’ ОН група на нуклеотида ще бъде получена и ензимът ДНК полимераза 1 ще действа върху нея. 5' до 3' екзонуклеазната активност на ДНК полимераза 1 отстранява нуклеотидите от ник в посока 3' на ДНК веригата. Едновременно с това работи полимеразната активност на ензима ДНК полимераза 1 и добавя нуклеотиди, за да замени отстранените нуклеотиди. Ако нуклеотидите са били белязани, заместването ще се извърши от белязаните нуклеотиди и ще маркира ДНК за идентификация. Тази новосинтезирана белязана ДНК може да се използва като проби в различни реакции на хибридизация в молекулярната биология.
Фигура 01: Процес на превод на псевдоним
Какво е Primer Extension?
Удължаването на праймера е техника, която се използва за намиране на специфична РНК последователност от РНК смес и локализиране на 5' края на иРНК транскрипта. Използва се и за изследване на структурата на РНК и експресията. Методът за удължаване на праймера се извършва с маркирани праймери или с маркирани нуклеотиди. Ако се използват маркирани праймери, това изключва необходимостта от маркиране на нуклеотидите, които се използват за синтеза на cDNA. Има няколко стъпки в тази техника. Започва с извличане на РНК от пробата. След това към сместа се добавя белязан олигонуклеотиден праймер заедно с необходимите съставки за синтезиране на сДНК на специфична РНК последователност. Грундът се отгрява с комплементарната последователност от сместа. Използвайки отгрята последователност на праймера като матрица, ензимът обратна транскриптаза синтезира комплементарната ДНК (сДНК) на РНК последователността. Отгряването на праймера и обратната транскрипция се случват само когато специфичната РНК последователност присъства в пробата. Накрая, когато се извършва денатурираща гел електрофореза, може да се определи размерът на РНК последователността. Също така е лесно да се намери +1 база на mRNA (сайт на иницииране на транскрипция) последователност чрез метода на удължаване на праймера. Количеството иРНК, присъстващо в пробата, може да бъде количествено определено чрез този метод, ако се използва излишък от праймер.
Фигура 02: Разширение на грунд
Каква е разликата между Nick Translation и Primer Extension?
Превод на Ник срещу разширение на Primer |
|
| Преводът на Ник е процес, който създава белязани ДНК проби за различни реакции на хибридизация. | Разширението на праймера е техника, използвана за намиране на специфична РНК или за изследване на генна експресия. |
| Използвани ензими | |
| Използват се ензими ДНКаза 1 и ДНК полимераза. | Използва се ензим обратна транскриптаза. |
| Важност | |
| Преводът на Ник улеснява маркирането на специфична ДНК последователност. | Разширението на праймера позволява откриване на специфичен размер на mRNA последователност и количеството, присъстващо в пробата. |
Резюме – Nick Translation vs Primer Extension
Преводът на Ник е метод, използван за синтезиране на белязани сонди въз основа на активността на ДНКаза 1 и ензимите ДНК полимераза 1 на E coli. Това е in vitro метод, използван в лабораториите преди различни техники за хибридизация. По време на ник транслацията, 5’-3’ екзонуклеазната активност на ДНК полимераза 1 отстранява нуклеотиди преди ник и полимеразната активност на ДНК полимераза 1 замества отстранените нуклеотиди с белязани нуклеотиди зад ник. Удължаването на праймера е метод, който се използва за откриване на специфичен РНК транскрипт от смес и количествено определяне на размера и количеството на интересуващата ни РНК. Това е разликата между превода на псевдоним и разширението на праймера.
