Ключова разлика – PCR праймери срещу праймери за секвениране
С последните разработки в областта на молекулярната биология бяха разработени различни генетични техники, които направиха процесите на изследване на различни направления на темата лесни и точни. PCR и други процедури за секвениране са две важни такива техники. Те използват различни подкомпоненти. Праймерите се считат за основен подкомпонент, общ както за PCR, така и за техниките за секвениране. PCR праймерите се използват за амплифициране на определена ДНК последователност, докато праймерите за секвениране се използват в контекста на секвениране на ДНК фрагмент с намерението да се разкрие неговия специфичен ред на нуклеотидната последователност. Това е ключовата разлика между PCR праймери и праймери за секвениране.
Какво представляват PCR праймерите?
Полимеразната верижна реакция (PCR) е генетична техника, която се използва в областта на молекулярната биология, за да се амплифицират едно или няколко копия на определен ДНК сегмент и да се получат много милиони идентични копия. При PCR реакция се използват различни компоненти, включително праймери. Праймерите са къси ДНК вериги с нуклеотидна дължина от 18-25, което ги прави съвместими с началната и крайната област на ДНК фрагментите, които трябва да бъдат амплифицирани. Грундовете могат да бъдат преден и обратен. Тези праймери се свързват с ДНК фрагмента в специфичните точки, където карат ДНК полимеразата да се свърже със специфичния праймер на мястото и да инициира синтеза на новата ДНК верига.
Изборът на праймери е важен аспект от PCR процеса. Изборът на дължината на грунда е важен. Идеалната дължина би била 18-25 нуклеотида. Ако дължината е твърде къса или твърде дълга, праймерите няма да се свържат с ДНК последователността, за да бъдат амплифицирани точно. Праймерите, които са твърде къси по дължина, водят до неспецифично отгряване на праймери в различни места на ДНК последователността.
Фигура 01: PCR праймери
Съдържанието на гуанин и цитозин (GC) в добрия праймер трябва да бъде в диапазона 40-60. Температурата на отгряване на праймера и температурата на топене са жизненоважни фактори по време на PCR. Температурата на топене трябва да се изчисли точно и температурата на отгряване на праймера трябва да бъде с 5 0C по-ниска от температурата на топене. Температурата на топене трябва да бъде 60 °C и 75 °C. Твърде високите или твърде ниските температури ще доведат до по-малко активна активност на ДНК полимераза.
Какво представляват праймерите за секвениране?
Праймерите за секвениране се използват в контекста на секвениране на ДНК фрагмент с намерението да се разкрие неговата специфична идентичност. За получаване на добри резултати от секвенирането са важни висококачествените праймери и шаблони. По този начин, когато се избират праймери, те трябва да бъдат уникални за конкретен регион, където желаем да секвенираме. Също така трябва да бъде с правилна ориентация, където последователностите обикновено се генерират от 3' до 5' краища на праймерите. В последователността трябва да липсва нежелана самохибридизация като образуването на бримки с фиби. Не трябва да съдържа последователно образуване на гуанинови бази.
Температурата на топене (Tm) на праймера трябва да е подходяща за условията на последователността. Следователно трябва да се намира между 52oC и 74oC. Получаването на олигонуклеотиди, които да се използват като праймер, трябва да бъде пречистено, за да се получи желаната пълна дължина на последователността. Ако олигонуклеотидите съдържат примеси, сигнализирането на последователността на праймера ще бъде насложено от различни места за праймиране и също ще намали броя на базовите клетки.
Фигура 02: Праймери за секвениране
Температурата на топене на праймера (Tm) на олигонуклеотид определя колко силни са хибридизирани една с друга комплементарните ДНК вериги. Tm може да се разглежда като термодинамично изчисление, където зависи както от ДНК последователности, така и от няколко условия, като концентрация на сол. Tm е важен по време на PCR, където се използва вариант, наречен циклично секвениране, за да се произведе група от дидезоксинуклеотидни терминирани фрагменти. Тук праймерът, който е секвениран, първоначално ще бъде закален алтернативно, след това удължен и накрая денатуриран за амплификация. Следователно стойността на Tm трябва да бъде между 52oC и 74o C. Синтезираните олигонуклеотиди могат да бъдат получени от лаборатории за синтез на ДНК/РНК съгласно избор. Малкият мащаб на синтез, който се използва за секвениране на ДНК, обикновено е 50 nmol. Също така най-важното е, че праймерите, използвани за секвениране, трябва да бъдат пречистени, за да не съдържат примеси, които ще предотвратят намаляването на качеството.
Какви са приликите между PCR праймерите и праймерите за секвениране?
- Както PCR праймерите, така и праймерите за секвениране са праймери, които се използват в процеса на амплификация на целева ДНК последователност.
- Както PCR праймерите, така и праймерите за секвениране са съставени от нуклеотиди.
- Както PCR праймерите, така и праймерите за секвениране са къси олигомери.
Каква е разликата между PCR праймери и праймери за секвениране?
PCR праймери срещу праймери за секвениране |
|
| PCR праймерите са къси ДНК вериги с дължина на нуклеотидната последователност 18-25, което ги прави съвместими с началния и крайния регион на ДНК фрагментите, които трябва да бъдат амплифицирани. | Праймерите за секвениране са къси олигомери, които се използват в контекста на секвенирането на ДНК фрагмент с намерението да се разкрие неговата специфична идентичност. |
| Функция | |
| PCR праймерите се използват за амплификация на определена ДНК последователност. | Праймерите за секвениране се използват в контекста на секвенирането на ДНК фрагмент с намерението да се разкрие неговата специфична идентичност. |
| Необходим брой праймери | |
| Два праймера; един прав праймер и един обратен праймер се използват като PCR праймери. | Необходим е само един праймер като праймер за секвениране. |
Обобщение – PCR праймери срещу праймери за секвениране
Праймерите за секвениране се използват в контекста на секвениране на ДНК фрагмент с намерението да се разкрие неговата специфична идентичност. Един праймер за секвениране ще бъде достатъчен, за да стартира процеса. За да се получат добри резултати от секвенирането, висококачествените праймери и шаблони са важни. По този начин, когато се избират праймери, те трябва да бъдат уникални за конкретен регион, където желаем да секвенираме. PCR праймерите са къси ДНК вериги с нуклеотидна дължина 18-25, която е съвместима с началната и крайната област на ДНК фрагментите, които трябва да бъдат амплифицирани. PCR праймерите могат да бъдат прав праймер и обратен праймер. Съдържанието на гуанин и цитозин (GC) в добрия грунд трябва да бъде в диапазона 40-60. Температурата на отгряване на праймера и температурата на топене са жизненоважни аспекти по време на PCR. Това е разликата между PCR праймери и праймери за секвениране.
