Ключова разлика – Микрочипове срещу РНК секвениране
Транскриптомът представлява цялото съдържание на РНК, налична в клетката, включително иРНК, рРНК, тРНК, разградена РНК и неразградена РНК. Профилирането на транскриптом е важен процес, за да се разберат клетъчните прозрения. Има няколко усъвършенствани метода за профилиране на транскриптоми. Микрочипове и РНК секвениране са два вида технологии, разработени за анализ на транскриптоми. Ключовата разлика между микрочипове и РНК секвениране е, че микрочиповете се основават на потенциала за хибридизация на предварително проектирани белязани сонди с целеви cDNA последователности, докато РНК секвенирането се основава на директно секвениране на cDNA вериги чрез усъвършенствани техники за секвениране като NGS. Микрочиповете се извършват с предварителното знание за последователностите, а секвенирането на РНК се извършва без предварителното знание за последователностите.
Какво е Microarray?
Microarray е здрав, надежден и високопроизводителен метод, използван за профилиране на транскриптоми от учени. Това е най-популярният подход за анализ на преписи. Това е евтин метод, който зависи от сондите за хибридизация.
Техниката започва с екстракция на иРНК от пробата и конструиране на cDNA библиотека от общата РНК. След това се смесва с флуоресцентно маркирани предварително проектирани сонди върху твърда повърхност (точкова матрица). Допълнителните последователности се хибридизират с белязаните сонди в микрочипа. След това микрочипът се промива и пресява и изображението се определя количествено. Събраните данни трябва да бъдат анализирани, за да се получат относителните профили на израза.
Приема се, че интензитетът на сондите с микрочипове е пропорционален на количеството транскрипти в пробата. Въпреки това, точността на техниката зависи от проектираните сонди, предварително познаване на последователността и афинитета на сондите за хибридизация. Следователно технологията с микрочипове има ограничения. Техниката на микрочипове не може да се извърши с транскрипти с ниско изобилие. Той не успява да диференцира изоформите и да идентифицира генетични варианти. Тъй като този метод зависи от хибридизацията на сондите, някои проблеми, свързани с хибридизацията, като кръстосана хибридизация, неспецифична хибридизация и т.н. възникват в техниката на микрочипове.
Фигура 01: Микрочип
Какво е РНК секвениране?
Секвенирането на РНК пушка (RNA seq) е наскоро разработена техника за секвениране на цял транскриптом. Това е бърз и високопроизводителен метод за профилиране на транскриптоми. Той директно определя количествено експресията на гените и води до задълбочено изследване на транскриптома. RNA seq не зависи от предварително проектирани сонди или предварително познаване на последователностите. Следователно методът RNA seq има висока чувствителност и способност за откриване на нови гени и генетични варианти.
Методът за секвениране на РНК се извършва чрез няколко стъпки. Общата РНК на клетката трябва да бъде изолирана и фрагментирана. След това, като се използва обратна транскриптаза, трябва да се подготви cDNA библиотека. Всяка кДНК верига трябва да бъде лигирана с адаптери. След това лигираните фрагменти трябва да бъдат амплифицирани и пречистени. Накрая, като се използва NGS метод, трябва да се извърши секвениране на cDNA.
Фигура 02: Секвениране на РНК
Каква е разликата между Microarray и РНК секвениране?
Микрочипове срещу РНК секвениране |
|
| Microarray е здрав, надежден метод с висока производителност. | Секвенирането на РНК е точен и високопроизводителен метод. |
| Цена | |
| Това е евтин метод. | Това е скъп метод. |
| Анализ на голям брой проби | |
| Това улеснява анализирането на голям брой проби едновременно. | Това улеснява анализирането на голям брой проби. |
| Анализ на данни | |
| Анализът на данни е сложен. | Повече данни се генерират в този метод; следователно процесът е по-сложен. |
| Предварителни познания за последователности | |
| Този метод се основава на хибридизационни проби, така че са необходими предварителни познания за последователностите. | Този метод не зависи от предварителното знание за последователността. |
| Структурни вариации и нови гени | |
| Този метод не може да открие структурни вариации и нови гени. | Този метод може да открие структурни вариации като сливане на гени, алтернативен сплайсинг и нови гени. |
| Чувствителност | |
| Това не може да открие разлики в експресията на изоформите, така че има ограничена чувствителност. | Това има висока чувствителност. |
| Резултат | |
| Това може да доведе само до относителни нива на изразяване. Това не дава абсолютна количествена оценка на генната експресия. | Дава абсолютни и относителни нива на изразяване. |
| Повторен анализ на данни | |
| Това трябва да се изпълни отново, за да се анализира повторно. | Данните от последователността могат да бъдат анализирани повторно. |
| Необходимост от специфичен персонал и инфраструктура | |
| Не са необходими специфична инфраструктура и персонал за микрочипове. | Специфична инфраструктура и персонал, необходими за секвенирането на РНК. |
| Технически проблеми | |
| Техниката на микрочипове има технически проблеми като кръстосана хибридизация, неспецифична хибридизация, ограничена степен на откриване на отделни сонди и др. | Техниката RNA seq избягва технически проблеми като кръстосана хибридизация, неспецифична хибридизация, ограничена степен на откриване на отделни сонди и др. |
| Пристрастия | |
| Това е предубеден метод, тъй като зависи от хибридизацията. | Отклонението е ниско в сравнение с микрочипове. |
Обобщение – Микрочипове срещу РНК секвениране
Методите за секвениране на микрочипове и РНК са високопроизводителни платформи, разработени за профилиране на транскриптоми. И двата метода дават резултати, които са силно свързани с профилите на генната експресия. Въпреки това, секвенирането на РНК има предимства пред микрочипове за анализ на генната експресия. Секвенирането на РНК е по-чувствителен метод за откриване на транскрипти с ниско съдържание в сравнение с микрочипове. Секвенирането на РНК също позволява диференциацията между изоформите и идентифицирането на генни варианти. Микрочиповете обаче са обичайният избор на повечето изследователи, тъй като секвенирането на РНК е нова и скъпа техника с предизвикателства за съхранение на данни и сложен анализ на данни.
