Ключова разлика – RAPD срещу RFLP
Генетичните маркери се използват в молекулярната биология за идентифициране на генетични вариации между индивиди и видове. Случайно амплифицираната полиморфна ДНК (RAPD) и полиморфизмът на дължината на рестрикционния фрагмент (RFLP) са два важни молекулни маркера, използвани рутинно в лабораториите. RAPD се извършва с къси и произволни олигонуклеотидни праймери и се основава на произволно усилване на множество места в шаблонната ДНК на организма. RFLP се извършва със специфична рестрикционна ендонуклеаза и се основава на полиморфизма на получените рестрикционни фрагменти и хибридизация. Ключовата разлика между RAPL и RFLP е, че RAPD е вид PCR техника, изпълнявана без предварителни познания за последователността, докато RFLP не участва в PCR и изисква предварителни познания за последователността, за да се изпълни техниката.
Какво е RAPD?
RAPD е полезен молекулярен маркер в молекулярната биология. Това е бърза и лесна техника. RAPD може да се дефинира като метод, който води до полиморфни ДНК последователности в резултат на произволна амплификация на множество места на целевия ДНК шаблон. RAPD използва къси олигонуклеотидни праймери с произволни последователности за PCR амплификация. Праймерите са изкуствено синтезирани без предварителното знание за последователността. Следователно се счита за лесна и полезна техника.
Следните основни стъпки са включени в RAPD.
- Извличане на целева ДНК
- Амплификация на множеството места на таргетната ДНК с помощта на произволно избрани праймери
- Гел електрофореза на амплифицирани PCR продукти
- Оцветяване с етидиев бромид и идентифициране на полиморфизма
В резултат на вариацията в отгряването на праймера, по време на амплификацията се генерират различни фрагменти с различна дължина. Следователно моделите на ленти върху геловете са различни при индивидите и видовете. По този начин RAPD дава възможност за откриване на генетични вариации сред организмите при идентификация и диференциация.
RAPD се прилага в различни изследвания на молекулярната биология като идентифициране на генетичната разлика между тясно свързани видове, генно картографиране, ДНК пръстови отпечатъци, идентифициране на наследствени заболявания и т.н.
Фигура 01: RAPD
Какво е RFLP?
Полиморфизмите на дължината на рестрикционния фрагмент (RFLPs) е молекулярен маркер, използван в молекулярната биология за идентифициране на генетична вариация в хомоложни ДНК последователности. Това е първият генетичен маркер, разработен за ДНК пръстови отпечатъци. Всички организми произвеждат уникални ДНК профили, когато са ограничени със специфични рестрикционни ензими. RFLP служи като важен инструмент за създаване на уникални ДНК профили на индивиди и откриване на генетични вариации сред тях. Когато ДНК пробите се усвояват със специфични рестрикционни ендонуклеази, се получават различни ДНК профили, които са уникални за всеки индивид. Следователно, принципът на този метод е откриването на генетична вариация сред организмите чрез ограничаване на хомоложна ДНК със специфични рестрикционни ензими и анализ на полиморфизма на дължината на фрагмента чрез гел електрофореза и блотиране. Моделите на петна са уникални за всеки организъм и характеризират специфичните генотипове.
Следващите стъпки са свързани с RFLP.
- Изолиране на достатъчно количество ДНК от проби
- Фрагментиране на ДНК пробите със специфични рестрикционни ендонуклеази в кратка последователност
- Разделяне на получените фрагменти с различна дължина чрез електрофореза в агарозен гел.
- Трансфер на профила на гела в мембрана чрез Southern blotting
- Хибридизация на мембраната с белязани сонди и анализ на полиморфизма на дължината на фрагмента във всеки профил
RFLP има различни приложения като диагностика на наследствени заболявания, картографиране на генома, криминална идентификация в съдебномедицински изследвания, тестове за бащинство и др.
Фигура 02: RFLP генотип
Каква е разликата между RAPD и RFLP?
RAPD срещу RFLP |
|
| RAPD е молекулярен маркер, базиран на произволни праймери и PCR. | RFLP е молекулярен маркер, базиран на производството на рестрикционни фрагменти с различна дължина. |
| Задължителна проба | |
| Малки ДНК проби са достатъчни за RAPD анализа. | Необходимо е голямо количество извлечена ДНК проба за RFLP анализ. |
| Час | |
| RAPD е бърз процес. | RFLP е процес, който отнема време. |
| Използване на грунд | |
| Използват се произволни праймери и едни и същи праймери могат да се използват за различни видове. | Специфични за вида сонди се използват в RFLP за хибридизация. |
| Надеждност | |
| Надеждността на техниката е по-малка в сравнение с RFLP. | RFLP е надеждна техника. |
| Попиване | |
| RAPD включва Southern blotting. | Southern blotting е една стъпка от RFLP. |
| Откриване на алелна вариация | |
| Алелните вариации не могат да бъдат открити от RAPD. | Алелните вариации могат да бъдат открити чрез RFLP. |
| Необходимост от знание за последователности | |
| RAPD не изисква предварително познаване на последователността. | Необходими са предварителни познания за последователността за проектиране на сонда. |
| PCR | |
| PCR е свързан с RAPD | PCR не е свързан с RFLP. |
| Възпроизводимост | |
| RAPD има ниска възпроизводимост | RFLP има висока възпроизводимост в сравнение с RAPD. |
Резюме – RAPD срещу RFLP
RAPD и RFLP са важни маркери, използвани в молекулярната биология. И двата метода са в състояние да открият генетични вариации сред организмите. RAPD се извършва с помощта на случайни праймери. RFLP се извършва с помощта на специфични рестрикционни ензими. И двата метода произвеждат ДНК профили, уникални за отделните организми. RAPD включва сравнително малко стъпки от RFLP. Но дава по-малко надеждни и възпроизводими резултати от RFLP. Това е основната разлика между RAPD и RFLP.
