Ключова разлика – клониране срещу субклониране
Клонирането и субклонирането са молекулярно-биологични процедури, които създават генетично идентични клетки или организми, носещи ДНК или гена, които представляват интерес. Клонирането е техника, която включва вмъкване на съответния ген или ДНК във вектор, репликацията му в бактерия гостоприемник и производство на клетки или организми, които са точни копия на генетичния състав. Субклонирането е техника, която включва вмъкване на гена, представляващ интерес, който вече е вмъкнат във вектор, във вторичен вектор, репликацията му в бактерията гостоприемник и производството на генетично идентични копия на клетки или организми. Ключовата разлика между клонирането и субклонирането е, че при клонирането генът, който представлява интерес, веднъж лигиран във вектор, продължава процеса на клониране, докато при субклонирането вече клонираният ген, който представлява интерес, се отделя от родителския вектор и се вмъква отново в вектор на получател и продължете процеса.
Какво е клониране?
Клонирането е процедура, която произвежда генетично идентични организми или клетки. В природата клонирането се извършва чрез безполово размножаване. Когато няма генетична рекомбинация или промяна, дъщерните клетки получават същия генетичен състав на родителя. Прокариотните и еукариотните организми създават клонове чрез бинарно делене, пъпкуване, митоза и т.н. В молекулярната биология клонирането на гени или специфични фрагменти от ДНК е популярен метод за изследване на структурата и функцията на тази конкретна ДНК секция.
Основната цел на молекулярното клониране е да се направят милиони копия на генетично идентични клетки или организми, носещи интересуващия ни ДНК фрагмент (главно гени). Създава организми с точни генетични копия на други. Основно специфични гени се клонират в молекулярни изследвания за получаване на структурна и функционална информация и за секвениране на ДНК. Също така, за производството на специфични протеини или продукти в голям мащаб, клонирането се използва широко.
Процедура за клониране
Основните стъпки на процедурата по клониране са както следва.
- Идентифициране и изолиране на интересуващия ни ген. (Амплификация на интересуващия ни ген чрез PCR).
- Рестрикционно смилане на интересния ген (рестрикционната ендонуклеаза прекъсва гена).
- Ограничаване на смилането на векторната ДНК. (Векторната ДНК също се нарязва с помощта на същата рестрикционна ендонуклеаза).
- Вмъкване на гена във вектора и образуване на рекомбинантната молекула.
- Трансформация на рекомбинантния вектор в бактерия гостоприемник.
- Изолиране и идентифициране на трансформираните бактерии (плазмидният вектор трябва да съдържа избираем ген, най-често ген за антибиотична резистентност за скрининг на трансформирани бактерии).
- Рекомбинантна генна експресия в гостоприемника.
Фигура_01: Процедура за клониране
Какво е субклониране?
Субклонирането е процедура на преместване на интересен ген от един вектор в друг вектор, за да се види експресията на гена, за да се получи желаната функционалност на гена. В този метод са включени два вектора; а именно родителски вектор и целеви вектор. Клонираните вложки се преместват отново във втори вектор при субклониране. Целта на прехвърлянето на гена от първия вектор към втория вектор е да се получи нещо, което не може да бъде направено от първия вектор или да се отдели отново ген в рамките на вече клонирания фрагмент от ДНК и да се експресира самостоятелно. Рестрикционните ензими се използват в тази процедура в началото.
Процедура за субклониране
Основните стъпки на субклонирането са както следва.
- С помощта на рестрикционни ендонуклеази, отделяне на интересуващата ни ДНК в донорния плазмид (родителски вектор).
- Амплификация на интересуващата ни ДНК чрез PCR.
- Пречистване на PCR продукта (ДНК от интерес) чрез гел електрофореза.
- Отваряне на реципиентния плазмид чрез същите рестрикционни ендонуклеази, използвани за разделяне на интересуващата ни ДНК в родителския плазмид.
- Лигиране на интересуващата ни ДНК (ген) в реципиентния плазмид за създаване на субклониран плазмид.
- Трансформация на субклонирания вектор в компетентна бактерия гостоприемник.
- Скрининг на трансформирани клетки.
- Пречистване на плазмидната ДНК и използване за секвениране на ДНК или експресия на гените за получаване на желаните продукти.
Субклонирането се извършва в случаите на изолиране на един ген от клонираната група гени или когато генът, който представлява интерес, трябва да се прехвърли в полезен плазмид, за да се види точната функция на гена, който представлява интерес.
Фигура_02: Процедура за субклониране
Каква е разликата между клониране и субклониране?
Клониране срещу субклониране |
|
| Клонирането е процедура, която произвежда генетично идентични организми или клетки. | Субклонирането е процедура на преместване на интересен ген от един вектор в друг вектор, за да се види експресията на гена, за да се получи желаната функционалност на гена. |
| Процес | |
| Отделете интересуващата ни ДНК от организма и я вмъкнете във вектор веднъж и клонирайте | Вече клонираната ДНК се отделя от първия вектор и се вмъква във втори вектор и се клонира. |
| Вмъкване на движение чрез вектори | |
| Не премества вмъквания (ДНК от интерес) от един вектор в друг вектор. | Преместване на вмъквания от родителски вектор към целеви вектор. |
Резюме – Клониране срещу субклониране
Клонирането създава генетично идентични клетки или организми с вмъкнатия ген или ДНК от интерес. Протича чрез отделяне и вмъкване на интересуващата ни ДНК във вектор и експресия в бактерия гостоприемник. Субклонирането споделя подобни стъпки с клонирането. Въпреки това, при субклониране, вече клониран ДНК фрагмент (представляващ интерес ген) се вмъква във вектор и се трансформира в бактерия гостоприемник. Това е основната разлика между клонирането и субклонирането.
