Ключова разлика – нитроцелулоза срещу PVDF
Western blotting е метод, който позволява откриване и количествено определяне на специфични протеини от протеинова проба. Надеждността на техниката зависи от избора на правилна мембрана за абсорбция на протеини от гела. Има различни видове микропорести мембрани. Нитроцелулозните и PVDF мембраните са две такива мембрани, предпочитани от изследователите поради техните специални качества пред другите видове мембрани. Изборът между нитроцелулозата или PVDF също е друго предизвикателство при Western blotting. Както нитроцелулозата, така и PVDF имат висок капацитет за абсорбиране на протеини. Ключовата разлика между нитроцелулозната и PVDF мембраната е, че нитроцелулозните мембрани нямат способността да отделят антитела и да използват повторно мембраната за повторно изследване на антитела, докато PVDF мембраните имат способност за отстраняване и повторно използване.
Какво е нитроцелулоза?
Нитроцелулозата е полимер, произведен чрез третиране на целулоза с азотна киселина и се използва за направата на микропорести мембрани в молекулярната биология, особено за техники за блотиране като южно, северно и западно блотиране. Размерът на порите на нитроцелулозните мембрани варира от 3 до 20 µm. Нитроцелулозните микропорести мембрани улесняват откриването на имунохимични реакции, протичащи на повърхността на мембраната. Следователно нитроцелулозните мембрани често се използват за имобилизиране на протеини и откриване на специфични протеини при Western blotting. Нитроцелулозните мембрани също могат да обездвижват гликопротеините и нуклеиновите киселини.
Нитроцелулозните мембрани са предпочитани при анализи на страничен поток поради няколко характеристики. Нитроцелулозните мембрани абсорбират протеини във висока концентрация. Разтворителят, използван за намокряне на мембраната, не намалява абсорбцията на нитроцелулозния мембранен протеин. Нитроцелулозните мембрани могат лесно да бъдат нарязани до желания размер на гела и да прехвърлят протеини от гела към мембраната чрез електрически или капилярен трансфер. Нитроцелулозата позволява по-бърз поток на протеини през мембраната с висок потенциал на свързване. Нитроцелулозата показва подобрена здравина на работа. Друго специално качество на нитроцелулозната мембрана е, че тя може лесно да бъде залепена с неразтворими водоустойчиви лепила върху различни пластмасови подложки.
Фигура 01: Нитроцелулозна мембрана за уестърн блотинг
Какво е PVDF?
Поливинилиден дифлуорид (PVDF) е флуорополимер, произведен чрез полимеризация на винилиден дифлуорид и има висока способност за имобилизиране на протеини. Следователно, микропорести мембрани, направени от PVDF, се използват в Western blotting техниките за анализ на специфични протеини от смеси от протеини. PVDF мембраните могат също да се използват за анализ на аминокиселини и секвениране на протеини. Най-важната характеристика на PVDF мембраната спрямо нитроцелулозната мембрана е, че тя може лесно да бъде отстранена от антителата и повторно използвана за последващи проби на антитела.
PVDF мембраните са по-дебели от нитроцелулозните мембрани; следователно по-устойчиви на повреди по време на повторна употреба. PVDF мембраните са силно хидрофобни. Следователно те трябва да бъдат накиснати в метанол или изопропанол преди употреба.
Каква е разликата между нитроцелулоза и PVDF?
Нитроцелулоза срещу PVDF |
|
| Нитроцелулозата е полимер, съставен от целулоза. | PVDF е флуорополимер, получен чрез полимеризация на винилиден дифлуорид. |
| Размер на порите на мембраната | |
| Типичните размери на порите са 0,1, 0,2 или 0,45μ | Типичните размери на порите са 0,1, 0,2 или 0,45 μm |
| Капацитет на свързване на протеини | |
| Нитроцелулозата има капацитет на свързване с протеини от 80 до 100 μg/cm2. | PVDF има капацитет на свързване с протеини от 170 до 200 μg/cm2. |
| Чувствителност | |
| Това има ниска чувствителност в сравнение с PVDF. | Това има висока чувствителност. |
| Откриване на слабо експресирани протеини | |
| Тъй като чувствителността е ниска в нитроцелулозните мембрани, тя не е подходяща за откриване на слабо експресирани протеини. | Това е по-подходящо за откриване на слабо експресирани протеини поради високата си чувствителност. |
| Фонов шум | |
| Това има по-нисък фонов шум | Това има по-висок фонов шум. |
| Взаимодействия с протеини | |
| Протеиновите молекули се свързват с нитроцелулозните мембрани чрез хидрофобни взаимодействия. | Протеините се свързват с PVDF мембраните чрез хидрофобни и диполни взаимодействия. |
| Природа на мембраната | |
| Нитроцелулозата е крехка и чуплива. Има обаче версии на нитроцелулоза, които са устойчиви. | PVDF е по-издръжлив и има по-висока химическа устойчивост. |
| Възможност за отстраняване и повторно използване | |
| Нитроцелулозата може да има затруднения при отстраняване и повторно сондиране без загуба на сигнала. | PVDF е идеален за повторно изследване и секвениране на приложения. |
| Пригодност | |
| Нитроцелулозата е идеална за откриване на протеини с ниско молекулно тегло. | PVDF е по-подходящ за откриване на протеини с по-високо молекулно тегло. |
| Други употреби | |
| Нитроцелулозата може да се използва за анализ на нуклеинови киселини и дот/слот блотинг. | PVDF може да се използва за секвениране на протеини и системи за анализ на твърда фаза. |
| Цена | |
| Това е по-евтино от PVDF мембраните. | Това е по-скъпо от нитроцелулозните мембрани. |
| Необходимост от предварително намокряне | |
| Нитроцелулозните мембрани не изискват предварително накисване с метанол | PVDF мембраните изискват предварително накисване с метанол. |
Резюме – Нитроцелулоза срещу PVDF
Нитроцелулозните мембрани са първите мембрани, използвани в търговската мрежа за анализ на страничния поток. Имат висок капацитет за усвояване на протеини. Следователно нитроцелулозните мембрани се използват при Western blotting. PVDF е друг вид мембрана, използвана в Western blotting, и също така има висок капацитет за абсорбиране на протеини. И двата типа се използват в Western blotting за протеинов анализ. PVDF мембраните обаче имат по-специални характеристики, което ги прави по-подходящи от нитроцелулозните мембрани за Western blotting. Но нитроцелулозните мембрани са по-подходящи за откриване на протеини с ниско молекулно тегло, PVDF мембраните са по-подходящи за откриване на протеини с високо молекулно тегло. Това е разликата между нитроцелулозните и PVDF мембраните.
