Ключова разлика – топла срещу студена трипсинизация
Топла и студена трипсинизация са два метода, използвани при ензимно разграждане на клетки при култивиране на животински клетки. Ключовата разлика между топла и студена трипсинизация, както подсказват имената, зависи от температурата, при която се добавя трипсинът за клетъчна дезагрегация. Топлият трипсин се извършва при по-високи температурни условия (36,5 – 37 0C), докато студеният трипсин се извършва при ниски температурни условия.
По време на процеса на първично клетъчно култивиране на животински клетки се използват три основни метода, които се оказаха успешни. Трите метода включват механична дезагрегация на клетки, ензимна дезагрегация на клетки и техника на първичен експлант. Ензимното разграждане на клетките, което води до изолирането на клетките и се извършва от ензима трипсин, разграждащ протеина. Следователно този процес е известен като трипсинизация. Трипсинизацията може да се извърши при две различни условия, а именно топла трипсинизация и студена трипсинизация. Топла трипсинизация е метод за третиране на клетките с трипсин при топли условия при температура 36,5 – 37 0C. Студената трипсинизация е процес на третиране с трипсин, който се извършва при по-студени условия, за предпочитане в лед, поддържащ много ниски температури.
Какво е топла трипсинизация?
Трипсинизацията може да се извърши за дезагрегиране на клетъчните компоненти, за да се изолират клетките за получаване на първична клетъчна култура. Трипсинът е ензим за разграждане на протеини и ензимната смес, използвана при трипсинизацията, може да бъде или суров екстракт, или пречистен продукт. Твърди се, че суровият екстракт е по-ефективен при протеинов лизис и клетъчна дезинтеграция, тъй като съдържа други разграждащи ензими.
Топлата трипсинизация е най-често използваният ензимен метод за клетъчна дезагрегация, който се извършва при по-високи температурни условия. Преди третирането чрез трипсинизация желаната тъкан се нарязва на по-малки парчета. Улеснява лесния процес на дезагрегиране. След това нарязаната тъкан се измива в специална среда, известна като дисекционна базална солна среда.
След завършване на етапа на измиване, клетките се трансформират в колба, съдържаща активния ензим, който е трипсин. Тъй като тази техника предполага топъл протокол за трипсинизация, трипсинът се поставя при температура от около 37 0C за около четири часа.
Фигура 01: Трипсин
Съдържанието се смесва и разбърква чрез използване на методи на центрофугиране за улесняване на протокола и за ускоряване на процеса на дезагрегиране. След достигане на препоръчаното време клетките могат да бъдат извлечени от супернатанта. След това клетките, получени от супернатантата, се инкубират при определена температура и време.
Какво е студена трипсинизация?
Студената трипсинизация е другият тип трипсинизация, която се извършва при студени условия. При тази техника клетките, които са нарязани и измити, се поставят във флакони върху лед и след това се накисват с трипсин. Периодът на накисване е много по-дълъг – около 6 – 24 часа.
След приключване на процедурата на накисване, трипсинът се отстранява от клетъчния лизат и парчетата тъкан се инкубират допълнително при 37 0C за около 20 – 30 минути. Дезагрегацията на клетките се осъществява чрез многократно пипетиране на тъканната смес. Това ще позволи на клетките да се отделят от мембраната и да стигнат до супернатанта. След като клетките са в супернатантата, те се инкубират и отглеждат при желаната температура и период от време.
Методът на студена трипсинизация има няколко предимства
- По-висок добив на жизнеспособни клетки, тъй като увреждането на клетките е сведено до минимум. Увреждането на клетките е сведено до минимум, като не се използват стъпки на центрофугиране.
- Изключително удобен метод.
- По-малко трудоемко.
Основното ограничение на метода на студена трипсинизация е, че не могат да се използват големи количества в един случай.
Какви са приликите между топла и студена трипсинизация?
- Процесите на топла и студена трипсинизация използват ензима трипсин за дезагрегация на клетките.
- Процесите на топла и студена трипсинизация се използват в процедурите за клетъчно култивиране за дезагрегация на клетките.
- И в процедурите за лечение с топла и студена трипсинизация клетките се извличат от супернатанта.
Каква е разликата между топла и студена трипсинизация?
Топло срещу студено трипсинизиране |
|
| Топла трипсинизация е метод за третиране на клетките с трипсин при топли условия при температура 36,5 – 37 0. | Студената трипсинизация е процес на третиране с трипсин, който се извършва при по-студени условия, за предпочитане в лед, като се поддържат много ниски температури. |
| Протокол | |
| Нарязаните парчета тъкан се поддържат при 37 0C непрекъснато през цялата процедура. | Нарязаните парчета тъкан първоначално се поддържат при ледено студени температури и след това се поддържат при 37 0. |
| Температура | |
| Топла трипсинизация настъпва при 36,5 – 37 0 | Студената трипсинизация възниква при ледено студени температури. |
| Консумирано време | |
| По-малко време, необходимо за целия процес (около 4 часа) на топла трипсинизация. | Необходимо е по-дълго време (около 6 – 24 часа) за студена трипсинизация. |
| Добив на жизнеспособни клетки | |
| Слаба топла трипсинизация. | Висока степен на студена трипсинизация. |
| Използване на центрофугиране | |
| Необходимо е центрофугиране за дезагрегация на клетки при топла трипсинизация. | Не е необходимо центрофугиране при студена трипсинизация. |
| Първоначално количество тъкан за трипсинизация | |
| Може да се използва по-голямо количество тъкан при топла трипсинизация. | По-малко количество тъкан може да се използва при студена трипсинизация. |
| Увреждане на клетката | |
| Високо поради центрофугиране при топла трипсинизация. | По-малко поради студена трипсинизация. |
Обобщение – Топла срещу студена трипсинизация
Трипсинизацията е методът за използване на разграждащия протеин ензим трипсин за дезагрегация и подготовка на първични клетъчни култури по време на процеса на клетъчно култивиране. Има две основни техники за трипсинизация въз основа на температурите, използвани по време на процедурата. Те са топла и студена трипсинизация. Топла трипсинизация се извършва при 37 0C, докато студената трипсинизация се извършва при ледено студени условия. Въпреки че студената трипсинизация отнема повече време за завършване, се казва, че има по-висок добив на жизнеспособни клетки. Това се дължи на факта, че увреждането на клетките е сведено до минимум при студена трипсинизация, тъй като не се използват енергични стъпки на центрофугиране. Това е разликата между топла и студена трипсинизация.
