Ключова разлика – хартия срещу тънкослойна срещу колонна хроматография
Хартиената хроматография, тънкослойната хроматография и колонната хроматография са три вида хроматографски техники. Ключовата разлика между хартиената хроматография, тънкослойната хроматография и колонната хроматография се основава на вида неподвижна фаза, използвана в хроматографската техника. Хартиената хроматография използва целулозна хартия като стационарна фаза, тънкослойната хроматография използва алуминиев оксид или силикагел като стационарна фаза, докато колонната хроматография използва колона, напълнена с подходящ матричен материал, като стационарна фаза.
В процеса на разделяне и идентифициране на биомолекули като протеини и въглехидрати, хроматографията е важна използвана биофизична техника. Хроматографията разделя съединенията въз основа на тяхната разтворимост, размер и заряд. Въз основа на механизма на разделяне, хроматографията използва механизми като йонообмен, абсорбция, разделяне и изключване на размера и има три хроматографски техники; а именно хартиена, тънкослойна и колонна хроматография. Хартиената хроматография се основава на твърдо-течната адсорбция и разтворимостта на съединението и използва целулозна хартия като неподвижна фаза. Тънкослойната хроматография се основава на твърдо-течна адсорбция на молекули. Той има неподвижна фаза, която обикновено е направена от алуминиев оксид или силикагел, и подвижната фаза, която е разтворителят. Колонната хроматография използва колона, пълна с матрица, която се използва за разделяне на молекули главно въз основа на техния размер, афинитет или заряд.
Какво е хартиена хроматография?
Хартиената хроматография е най-простият използван тип хроматография и не се използва за обширни изследвания. Използва се главно в студентски лаборатории за идентифициране на биомолекули като аминокиселини и въглехидрати, присъстващи в смеси. Хартиената хроматография използва неподвижна фаза, която се прави с помощта на целулозна хартия или филтърна хартия Whatman, и подвижна фаза, която обикновено се приготвя с помощта на органични разтворители като n-бутанол и др. Стационарната фаза се насища с вода, което прави стационарната фаза течна. По този начин, когато съединенията се забелязват и се оставят да работят в присъствието на подвижната фаза, в зависимост от разтворимостта на съединенията, те се разделят. По този начин, при разработването на хроматограмата, може да се направи оцветяване, за да се определи дължината на цикъла на всяко съединение. По този начин може да се изчисли факторът на задържане.
Фигура 01: Хартиена хроматография
Хартиената хроматография може допълнително да се класифицира като възходяща хартиена хроматография и низходяща хартиена хроматография в зависимост от посоката на движещия се разтворител.
Какво е тънкослойна хроматография?
Тънкослойната хроматография или TLC е често използвана техника за идентифициране на различни аминокиселини, присъстващи в смес или за идентифициране на протеини. Техниката на разделяне се основава на адсорбцията твърдо-течно. По време на тънкослойна хроматография като неподвижна фаза се използва плоча, направена от алуминиев оксид или силикагел. Сместа от разтворители варира в зависимост от изискванията и може да използва различни комбинации от органични съединения като n-бутанол, оцетна киселина и вода за приготвяне на разтворителя. Съединенията, които трябва да се разделят, се нанасят върху плочата и се потапят в сместа от разтворители. След като разтворителят се придвижи нагоре въз основа на капилярното действие, дадено от плочата, съединенията, забелязани върху плочата, също се движат в зависимост от тяхната разтворимост в разтворителя.
Фигура 02: Тънкослойна хроматография
Откриването на петна след хроматограмата се извършва чрез различни процедури на оцветяване. Някои използват оцветяване с нинхидрин, което е доста токсичен метод за оцветяване. Съвременните тънкослойни хроматограми използват флуоресцентни техники за преглед на хроматограмата след цикъла. В зависимост от разстоянията, които е изминал, може да се изчисли времето на задържане на всяко съединение. Това може да се използва за идентифициране на вида на отделеното съединение въз основа на използваната смес. TLC се използва главно за идентифициране на аминокиселини в протеинова смес, а също и за разделяне на различни видове монозахариди, присъстващи в смес.
Какво е колонна хроматография?
Колонна хроматография е широк термин, използван за описание на много видове хроматографски техники, които използват базиран на колона метод за разделяне. В колонната хроматография се използва физическа колона с опаковъчен материал за разделяне на съединенията. Разделянето може да се основава на различни физични свойства, проявени от съединенията. Тези свойства могат да бъдат заряд, размер, 3D конформация и капацитет на свързване и т.н. По този начин колоната, напълнена с матричен материал, действа като стационарна фаза, а промиващият буфер, приложен към колоната, действа като подвижна фаза.
Ако молекулите са разделени въз основа на размера, опаковъчният материал е опакован по начин, който оставя пори за преминаване на съединенията. По този начин по-големите молекули, които не могат да преминат през порите, се елуират първи, докато по-малките молекули отнемат много повече време за елуиране.
Фигура 03: Колонна хроматография
Ако молекулите са разделени въз основа на техния заряд, стационарната фаза ще съдържа или анионен, или катионен обменник, към който съединенията ще бъдат привлечени въз основа на техния заряд. Така по време на етапа на промиване, несвързаните съединения ще бъдат елуирани. При добавяне на буфера за елуиране, свързаните заредени съединения ще бъдат елуирани. Откриването на тези елуенти се основава най-вече на спектрофотометрични техники.
Какви са приликите между тънкослойната хартиена хроматография и колонната хроматография?
- Всички три техники за тънкослойна хартиена и колонна хроматография се използват за разделяне на биомолекули като аминокиселини, протеини и въглехидрати.
- Техниките за тънкослойна и колонна хроматография на хартия имат подвижна фаза и неподвижна фаза.
- Техниките за тънкослойна и колонна хроматография с хартия използват биофизични механизми за разделяне.
Каква е разликата между тънкослойна хартия и колонна хроматография?
Хартия срещу тънък слой срещу колонна хроматография |
|
| Хартиена хроматография | Хартиената хроматография е хроматографска техника, използвана за разделяне на съединения въз основа на адсорбцията течност-течност и разтворимостта на съединението. Използва целулозна хартия като неподвижна фаза. |
| Тънкослойна хроматография | Тънкослойната хроматография е друга хроматографска техника, базирана на твърдо-течна адсорбция на молекули. Той има неподвижна фаза, направена от алуминиев оксид или силикагел и разтворител като подвижна фаза, която е разтворителят. |
| Колонна хроматография | Колонната хроматография използва колона, пълна с матрица, която се използва за разделяне на молекули главно въз основа на техния размер, афинитет или заряд. |
| Стационарна фаза | |
| Хартиена хроматография | Хартията от нитроцелулоза на Whatman се използва като неподвижна фаза в хартиената хроматография. |
| Тънкослойна хроматография | Двуалуминиевият оксид или силикагелът се използва като стационарна фаза на тънкослойната хроматография. |
| Колонна хроматография | Колона, напълнена с подходящ опаковъчен материал, се използва като неподвижна фаза в колонната хроматография. |
| Мобилна фаза | |
| Хартиена хроматография | Текущият разтворител е подвижната фаза на хартиената хроматография. |
| Тънкослойна хроматография | Текущият разтворител е подвижната фаза на тънкослойната хроматография. |
| Колонна хроматография | Промивният буфер е подвижната фаза на колонната хроматография. |
| Механизми, използвани за разделяне | |
| Хартиена хроматография | Хартиената хроматография се основава на абсорбция твърдо-течно. |
| Тънкослойна хроматография | Тънкослойната хроматография се базира на абсорбция твърдо-течно. |
| Колонна хроматография | Колонната хроматография се основава на изключване на размера, заряд и форма. |
| Елуиращ буфер | |
| Хартиена хроматография | Не се изисква от хартиена хроматография. |
| Тънкослойна хроматография | Не се изисква за тънкослойна хроматография. |
| Колонна хроматография | Изисква се при колонна хроматография. |
| Откриване | |
| Хартиена хроматография | Оцветяване и чрез определяне на фактора на задържане. |
| Тънкослойна хроматография | Оцветяване и чрез определяне на фактора на задържане. |
| Колонна хроматография | Спектрофотометрично определяне. |
Обобщение – тънкослойна хартия срещу колонна хроматография
Хартиената хроматография, TLC и колонната хроматография са техники за разделяне, използвани за разделяне на биомолекули като протеини, аминокиселини и въглехидрати (главно монозахариди). Хартиената хроматография използва целулозна хартия като неподвижна фаза, а механизмът на разделяне се основава на адсорбция твърдо-течно. TLC също използва механизми за адсорбция твърдо-течно. Молекулите се разделят на стационарната фаза в зависимост от тяхната разтворимост в подвижната фаза. Колонната хроматография използва физични свойства като размер, форма, заряд и молекулно тегло на съединението за разделяне. Колоната, напълнена с матричен материал, действа като неподвижна фаза, докато промиващият буфер действа като фаза на разтворителя. Това е разликата между тънък слой хартия и колонна хроматография.
