Ключовата разлика между Golden Gate и Gibson Assembly е, че Golden Gate разчита на наличието на рестрикционни сайтове в определена последователност за клониране, докато Gibson Assembly не разчита на наличието на рестрикционни сайтове в определена последователност за бъде клониран.
През последните десетилетия молекулярните учени разработиха различни стандартизирани процедури, които позволяват по-лесното сглобяване на множество ДНК фрагменти в едно цяло. Поради това методи за клониране като лигиране с рестрикционен ензим, клониране на шлюз, сглобяване на Gibson, сглобяване на Golden Gate и клониране на TOPO се използват широко от изследователите в научни експерименти. Следователно Golden Gate и Gibson Assembly са два метода за молекулярно клониране, които позволяват сглобяването на множество ДНК фрагменти в едно цяло.
Какво е Golden Gate Assembly?
Golden Gate е метод за молекулярно клониране, който улеснява сглобяването на множество ДНК фрагменти в едно цяло. Този метод разчита на наличието на рестрикционни сайтове в определена последователност, която трябва да бъде клонирана. Тя възниква през 1996 г. Тази техника използва рестрикционни ензими тип IIS и T4 ДНК лигаза. Тези ензими разрязват ДНК извън местата за разпознаване. Те могат да създават не-палиндромни надвеси. Следователно множество фрагменти от ДНК могат да бъдат сглобени с помощта на комбинации от надвиснали последователности.
Фигура 01: Golden Gate
Процедура за сглобяване на Golden Gate
Техниката Golden Gate има три основни стъпки в своята процедура:
- създаване на надвеси във вектора за клониране,
- сглобяване на множество ДНК вмъквания чрез използване на специфични за фрагмент последователности в надвеси и
- лигиране.
Сглобяването на Golden Gate използва кръгови вектори за клониране (дестинационен вектор). Освен това, при този метод, мястото на рестрикцията се елиминира от лигирания продукт, за да се извършат смилането и лигирането едновременно. Типичният протокол за термичен цикъл за Golden Gate варира между 37 °C и 16 °C, тъй като 37 °C е оптимално за рестрикционните ензими, а 16 °C е оптимално за лигазите.
Какво е Gibson Assembly?
Gibson Assembly е метод за молекулярно клониране, който позволява сглобяването на множество ДНК фрагменти в едно цяло. За разлика от метода Golden Gate, този метод не разчита на наличието на рестрикционни сайтове в определена последователност, която трябва да бъде клонирана. Открит е от Даниел Г. Гибсън от института Дж. Крейг Вентър. Тази техника е вид метод на клониране, независимо от последователността и лигазата (SLIC).
Фигура 02: Монтаж на Gibson
Процедура за сглобяване на Gibson
Gibson Assembly се нуждае от ДНК фрагменти, съдържащи 20-40 базови двойки, припокриващи се със съседни ДНК фрагменти. Припокриванията се добавят чрез PCR. След това тези ДНК фрагменти се добавят към мазерната смес на Gibson, която има три ензима. Тази процедура се провежда при изотермични условия (50 °C за 1 час), като се използват три различни ензима: екзонуклеаза, ДНК полимераза и ДНК лигаза. Екзонуклеазата дъвче обратно ДНК от 5' края. По този начин той не инхибира полимеразната активност и позволява реакцията да протече в един единствен процес. Получените едноверижни региони на съседни ДНК фрагменти могат да бъдат закалени поради припокриващи се последователности. ДНК полимеразата запълва празнините чрез добавяне на нуклеотиди. И накрая, ДНК лигазата ковалентно се свързва с ДНК на съседни сегменти. Обикновено Gibson Assembly използва линеаризирани дестинационни вектори. Освен това, този метод може едновременно да комбинира до 15 ДНК фрагмента въз основа на сходството на последователностите.
Прилики между Golden Gate и Gibson Assembly
- Golden Gate и Gibson Assembly са два метода за молекулярно клониране.
- И двата метода могат да сглобят множество ДНК фрагменти в едно цяло.
- Тези методи използват дестинационни вектори.
- И двата метода използват термоциклери за сглобяване на множество ДНК фрагменти.
- Използват се в сайт-насочена мутагенеза.
Разлика между Golden Gate и Gibson Assembly
Golden Gate е метод за молекулярно клониране, използван при сглобяването на множество ДНК фрагменти в едно парче, разчитайки на наличието на рестрикционни сайтове в определена последователност, която трябва да се клонира, докато Gibson Assembly е метод за молекулярно клониране, използван в сглобяване на множество ДНК фрагменти в едно парче, без да се разчита на наличието на рестрикционни сайтове в определена последователност, която трябва да бъде клонирана. Това е ключовата разлика между Golden Gate и Gibson Assembly. Освен това, методът Golden Gate използва кръгов дестинационен вектор, докато методът на Gibson Assembly използва линеаризиран дестинационен вектор.
Следната инфографика представя в таблица разликата между Golden Gate и Gibson Assembly.
Резюме – Golden Gate срещу Gibson Assembly
Молекулярното клониране е метод, използван за сглобяване на рекомбинантни ДНК молекули и насочване на тяхната репликация в организмите гостоприемници. Golden Gate и Gibson Assembly са два метода за молекулярно клониране, които позволяват сглобяването на множество ДНК фрагменти в едно цяло. Методът Golden Gate разчита на наличието на рестрикционни сайтове в определена последователност, която трябва да бъде клонирана, докато Gibson Assembly не разчита на наличието на рестрикционни сайтове в определена последователност, която трябва да се клонира. Така това е ключовата разлика между Golden Gate и Gibson Assembly.
